一、离心原理概述

离心是利用离心力加速样本中不同组分按密度、质量、颗粒大小等物理属性分层分离的过程。在一定离心力下，大质量或高密度颗粒会更快沉降，而轻质组分则留在上清液中。微量离心机通常处理样本体积为0.2–2 mL的微量试管，通过调节转速和时间实现精准分离。

在这个过程中，离心力（RCF）与样本分离效率成正相关，而时间和样本浓度也会对结果产生影响。单次长时间离心通常用于快速沉降目标组分，而多次离心则有助于分级分离、逐步纯化或更换缓冲体系。

二、单次离心的特点与应用场景

1. 操作简便，节省时间

单次离心流程简单，一次设置完成操作，适用于时间紧张或高通量实验，如临床样本的前处理、尿液或血清快速清除杂质等。

2. 适用于明确目的的快速分离

当目标组分密度远高于背景组分时，如全血样本中分离血浆、细胞培养液去除细胞碎片，单次高速离心往往能实现理想分离效果。

3. 限制与风险

• 纯度受限：由于一次性不能分步去除杂质，可能导致目的产物中夹带多种背景物质；

• 高剪切应力风险：长时间高速运转可能损伤脆弱的细胞器或核酸结构；

• 缓冲液更换不便：无法在不同步骤间引入洗脱或再悬液调整。

三、多次离心的优势及适用情境

1. 分级分离，提高纯度

在细胞组分分析中，如分离细胞核、线粒体和细胞膜，通常采用“差速离心”策略，依靠不同速度和时间依次沉降不同组分，实现结构化分离和高纯度制备。

2. 降低损耗，保护生物活性

通过中速、短时多次离心，可以减少样本暴露在高剪切力下的时间，有利于保持生物大分子的天然构象和功能活性。例如，在提取功能蛋白或活细胞时，多次温和离心更可取。

3. 缓冲液替换与纯化提升

多次离心常配合重悬、洗涤或缓冲液更换步骤使用，如DNA提取时的乙醇沉淀和清洗，能显著减少杂质残留，提高产物纯度。

四、具体实验案例比较

案例一：细胞核提取

在提取细胞核过程中，通常采用如下多次离心流程：

1. 低速离心去除细胞碎片；

2. 中速沉淀细胞核；

3. 再次洗涤细胞核沉淀，剔除胞浆污染。

此流程若改为单次高速离心，虽然时间缩短，但细胞核常夹杂过多胞浆成分，影响下游蛋白或核酸分析。

案例二：DNA纯化

商业化DNA提取试剂盒中，多次离心配合柱纯化，包含：

• 上样；

• 洗脱缓冲液冲洗（多次离心）；

• 最终洗脱回收。

若只进行一次离心，残留的蛋白、盐离子将严重影响DNA质量和后续酶反应。

五、影响选择的因素分析

1. 样本类型

• 低浓度稀释样本（如脑脊液）需多次浓缩离心；

• 高粘度样本（如血液）适宜逐步去杂。

2. 分离目的

• 若仅需除杂质 → 单次；

• 若目标为高纯度产物 → 多次。

3. 离心设备性能

部分高端离心机支持程序设定，可将多段离心自动化进行，提升效率。若设备限制不支持多次设定，操作繁琐可能成为瓶颈。

4. 实验人员技术水平

多次离心需严格控制步骤一致性，防止重悬不充分、上清残留等操作误差，要求操作人员具备一定经验。

六、安全性与样本完整性的考量

多次离心的风险：

• 重复操作增加污染风险；

• 多次开启离心机盖易产生样本挥发、气溶胶污染。

单次离心的风险：

• 高速条件下如未正确配平，可能损坏仪器；

• 样本沉淀过紧，难以重悬。

为此，实验应在生物安全柜中操作，并确保使用带密封盖的适配转子，避免气溶胶散播。