微量离心机离心外泌体的超速离心条件？
一、实验原理与概述
外泌体（Exosome）是一类直径约30–150 nm 的细胞外颗粒，其分离常采用差速超速离心法。该方法依次利用不同离心力去除细胞、细胞碎片和大颗粒，最终以高转速将外泌体从上清液中沉淀。微量超速离心机配备高转速微量定角转子，可在极低体积样品中达到
二、仪器与试剂准备
仪器
微量超速离心机及定角转子（转子型号示例：TLA-100.3、TLS-55、F50L-24x1.5）。
低温冷冻离心机（用于预处理步骤，最高转速约20,000 rpm）。
微量超滤装置（可选，用于浓缩）。
聚丙烯或聚碳酸酯超速离心管，壁厚均一，无热膨胀痕迹；
确保刻度准确，与转子匹配且无明显划痕/裂纹。
缓冲液与溶剂
无菌磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，预冷至4 °C；
可选：S30缓冲液、含蛋白酶抑制剂的PBS。
样品
来源：细胞培养上清、血清、尿液等；
预过滤（0.22 μm 滤器）以去除大颗粒。
三、差速超速离心流程
以下步骤在4 °C条件下进行，离心机与转子需事先预冷至少30分钟。
低速离心：去除细胞与大碎片
条件一：400 × g，10 分钟；
转速示例：使用低速转子，约1,500 rpm；
目的：沉降完整细胞。
中速离心：去除细胞碎片与微球
条件二：2,000 × g，20 分钟；
转速示例：4,000 rpm；
目的：沉降细胞碎片、大囊泡。
次高速离心：去除大囊泡与细胞碎屑
条件三：10,000 × g，30 分钟；
转速示例：10,000 rpm；
目的：去除较大微粒、细胞残余。
超速离心：首次沉淀外泌体
条件四：100,000 × g，70 分钟；
转速转换：根据转子半径R（mm），套用公式 RPM≈√(RCF/(1.118×10⁻⁵×R))。
例如R=56 mm时，约40,000 rpm。
离心管装载：管壁与转子槽内壁平行，且液面与管口齐平，以防失衡。
制动：轻柔制动（acceleration 9、brake 2）或关闭制动，防止悬浮颗粒扰动。
洗涤与二次超速离心
弃去上清，小心避免扰动沉淀；
重悬于1 mL 冷PBS，轻轻吹打；
条件五：100,000 × g，70 分钟；
目的是去除残余蛋白和污染；
结束后弃上清，保留粒子沉淀即为外泌体。
四、关键参数与注意事项
温度控制
全程保持4 °C，若离心机带制冷功能，设定4 °C；若无，则可将转子与离心管提前置于冰浴中。离心因子与k-factor
k-factor越低，分离效率越高，可适当缩短离心时间；
建议使用k-factor<50的定角转子。
装载平衡
各管装载质量误差不超过0.01 g；
对称放置管子，避免离心机剧烈振动。
不同材料会影响颗粒回收率，聚碳酸酯管回收比聚丙烯稍高；
重复使用前须严格清洗、灭菌，避免蛋白吸附或污染。
转速校准
定期校准仪器，确保转速与离心力一致；
使用转速校正工具或由厂家售后检测。
样品体积
每次离心体积建议不超过管最大容量的80%，以保证离心效率；
若需处理大体积，可分多管进行或结合超滤浓缩。
五、外泌体鉴定与质量控制
颗粒大小与浓度检测
纳米颗粒追踪分析（NTA），可测得颗粒直径及浓度分布；
动态光散射（DLS）辅助手段。
电镜观察
负染透射电镜（TEM）可直观显示双层膜结构；
样品预处理：将外泌体悬浮液滴于铜网后负染。
蛋白印迹（Western blot）
外泌体标志蛋白：CD9、CD63、TSG101等；
细胞内污染标志：Calnexin，用以排除细胞碎片。
功能验证
体外摄取实验：荧光标记后观察靶细胞内吞；
生物活性测试：例如改善内皮细胞迁移、调节免疫反应等。
六、常见问题与解决方案
沉淀量少
原因：上清液吸取过多；
对策：留用0.2 mL残液轻轻吹打，避免遗漏。
上清浑浊
原因：离心不彻底或转速过低；
对策：检查仪器校准，适当延长离心时间。
颗粒聚集
原因：离心加速度过大或制动方式不当；
对策：减少acceleration，关闭制动或采用级联制动。
管壁蛋白吸附
原因：管材质或未预涂防粘剂；
对策：使用低吸附离心管，预先涂布1% BSA。
七、流程优化与替代方法
密度梯度离心
在蔗糖或 OptiPrep 梯度中分离，提高纯度；
梯度设定：5%–40%连续或不连续，梯度离心100,000 × g，16 小时。
免疫亲和法
抗体偶联磁珠捕获特定表面标志；
无需超速离心，适合特异性纯化。
尺寸排阻色谱
基于颗粒直径分离，操作简便；
可联用 NTA 校正。
