一、离心力（RCF）与转速设置不当
离心力（Relative Centrifugal Force, RCF）是影响沉淀效率的关键参数，与转速（rpm）和转子半径呈正比关系。实际操作中常误用转速替代RCF，导致设定的g力不足以克服颗粒在液相中布朗运动和湍流阻力。对于直径小于0.5 μm的纳米颗粒或低密度胞质蛋白，应选用≥12,000×g；而大型细胞碎片和二极沉淀则可适当降低至5,000–8,000×g。如果RCF设定过低，颗粒沉降速度减慢，上清难以完全清晰。

二、离心时间不足或过长
时间与RCF共同决定沉淀效率。时间过短，颗粒尚未有足够动能沉降至管底；过长则可能导致二次沉淀或赘余杂质聚集，影响再悬浮和定量测定。针对不同粒径和浓度，应在初步试验中梯度测试离心时间，如5, 10, 15, 20分钟，然后根据沉淀清晰度与回收率折中选择。经验表明，多数蛋白复合物在12,000×g条件下离心10–15分钟可获得较好效果。

三、样本粘度与表面活性剂影响
高粘度溶液（如含DNA或多糖）会显著减缓颗粒沉降速度，造成沉淀不彻底。此时可通过预处理方法（如超声波剪切、DNA酶处理）降低粘度，或加入温和的非离子表面活性剂（如Triton X-100、Tween-20）以改善流体动力学特性。但表面活性剂浓度过高会干扰沉淀或引入污染，建议≤0.1%。

四、缓冲液成分与pH不合适
缓冲液的离子强度、pH值和添加剂对颗粒带电性及聚集状态有重要影响。例如，低离子强度下带相同电荷的颗粒之间排斥力增大，不易聚凝；过高离子强度又可能造成非特异性吸附或盐析。目前常用PBS、Tris-HCl缓冲液应根据目标颗粒性质调整NaCl浓度（100–300 mM）和pH（6.8–8.0），并可添加Ca²⁺/Mg²⁺以促进细胞碎片聚集。

五、离心管材质与样本体积
微量离心管常见材质包括聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）。PP管耐低温、耐溶剂并具有较好热传导性，适合大多数实验；PS管易碎且导热慢，容易在长时间低温或高速离心中导致管壁积液或局部结冰，影响样本集中。样本体积过大或过少均会影响重力分离：过大导致旋翼腔内热交换不均，过少则离心管底部聚集区狭小，沉淀分布分散。一般建议管内体积控制在管容量的30%–70%。

六、温度控制与冷却系统故障
温度对样本稳定性和粘度有显著影响。若离心机冷却系统故障或预冷时间不足，管腔内温度上升，样本粘度下降可能导致二次溶出；温度过低则增大样本黏稠度、降低重力分离效率。此外，温度梯度会让管底和管颈温差显著，形成热对流，带动微颗粒从管底回流至上清层。保证制冷系统正常运行，并在离心前预冷转子与管架，可有效维持4 ℃或所需温度。

七、操作不平衡与转子磨损
离心机在不平衡状态下运行，会导致机械振动，偏振部位的样本沉淀受扰动后重新悬浮，造成沉淀不均匀。应严格成对装样，与相对位置保持相同体积和质量；若仅一管样本，则需使用质量相当的平衡“空管”。长期高速运转还会导致转子扭曲或轴承磨损，加剧运行偏差，每月需进行动态平衡测试和转子目视检查。

八、样本前处理与预离心不足
复杂样本（如组织匀浆、细胞裂解液）通常含有大块细胞碎片、膜片或浆膜，应在微量离心前进行低速预离心（3,000–5,000×g，5–10 min）去除大颗粒，然后将上清转移至新管进行高速离心。若省略预离心，超大颗粒会占据管底表面积，阻碍后续小颗粒沉降，使沉淀层中混杂不均。

九、二次吸附与管壁残留
离心后弃取上清时，如使用吸头过于靠近管壁或倾倒不平稳，会带走部分沉淀；而吸头插入过深又会扰动沉淀层。最佳操作是轻轻倾倒上清或使用细口吸头，但要保证吸头口与管壁垂直切口并略高于沉淀顶端1–2 mm。同时，离心管内壁残留的微量蛋白或颗粒极易形成二次吸附，建议使用低结合管或在缓冲液中添加微量BSA减少吸附。

十、试剂稳定性与生物活性降解
在蛋白质或酶类颗粒的沉淀实验中，若长时间暴露于高温或含活性蛋白酶环境，样本易发生降解或自溶，形成可溶性碎片，导致实际沉淀量不足。可在缓冲体系中加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、EDTA）并全程保持低温，还可在裂解后立即添加分离介质或蛋白聚集剂（如PEG、NH₄₂SO₄）促进目标蛋白沉淀。

十一、转子类型与K因子匹配
不同转子类型（固定角度、摆动过滤或水平转子）具有不同的沉降路径和K因子。固定角度转子虽然速度快，但沉淀层呈蛋糕状，横截面积小，容易堵塞；摆动转子沉降路径更垂直，沉淀分布均匀，但需要更长时间。根据样本特点，应选择合适转子并在操作手册中查阅K因子，计算理论沉降时间并调整实践参数。

十二、仪器校准与维护管理
定期对离心机的转速、温度和时间控制模块进行校准，以确保读数准确。每季度进行一次全面维护，包括清理内部积尘、检测密封件状况、更换老化O形圈、检查冷凝排水管道通畅，以及对转子进行目视和非破坏性检测。只有在仪器性能达到标称状态时，才能保证沉淀实验的重复性和可靠性。

十三、数据记录与参数优化
在实验过程中，建立详细的离心记录簿，记录每次实验的RCF、时间、温度、样本类型、体积、转子型号等参数，并结合沉淀量、上清透明度和回收率进行对比分析。通过多组参数矩阵实验，找出最优组合，形成标准操作流程（SOP），可大幅度提高实验效率并减少批次间差异。