离心机在血栓检测样本处理？
一、引言
血栓检测是临床血液学和血管病学诊断中的重要环节，对防治心脑血管疾病、深静脉血栓、肺栓塞等具有重大意义。在血栓检测中，从患者血液样本中分离出有代表性的组分，确保样本质量与检测准确性至关重要。离心机作为分离细胞、血浆及血小板等组分的核心设备，其转速、离心时间、温度和操作规范等直接影响血栓成分的检测结果。本文将从样本采集、预处理、离心分层、血栓成分富集、上清回收到下游检测衔接等方面，系统阐述离心机在血栓检测样本处理中的应用要点与注意事项。
二、样本采集与初步处理
抗凝剂选择与管型
常用抗凝剂包括柠檬酸钠（3.2%或3.8%），能有效抑制凝血酶，保持血液流动性。
采血管型宜选用专用蓝盖管（3.2%柠檬酸盐），体积一般为2.7 mL，以确保抗凝剂与血液比为1∶9。
采血操作规范
静脉穿刺过程中应避免剧烈牵拉或反复抽送，以防微小纤维蛋白网提前形成。
采血完成后轻轻颠倒管壁5～6次，使抗凝剂均匀分布；切忌剧烈振荡，防止形成微小气泡，影响检测。
样本运输与储存
采集后应立即置于室温（20～25℃）或4℃冰盒中，运输时间不超过2小时；
若需要延长保存，可在4℃条件下暂存不超过4小时，避免长时间低温诱发血小板激活或微凝块形成。
三、离心前预处理
温度平衡
离心机与采血管在同一实验室环境下预热或预冷，确保仪器与样本温度差＜2℃，以免温差导致机腔凝露或管壁结露。
样本质量评估
肉眼观察样本无明显血细胞沉淀、凝块或脂血浑浊；若发现混浊或预凝块，应予以标记并重新采集；
使用低速预离心（500×g，5分钟）去除大型细胞团或纤维蛋白聚集体，得到澄清血浆，保证后续高效分层。
四、离心分层方案设计
单步分离（血浆与血细胞）
典型条件：1 500×g，10 min，室温；
适用于血栓标志物（如D-二聚体、纤维蛋白原）常规定量检测；
离心后血细胞压成一层，血浆位于上层，仔细避开细胞层吸取上清。
二步分离（富集血小板或微粒体）
第一步：1 500×g，10 min，室温，回收上清；
第二步：2 000×g，15 min，4℃，富集血小板微粒或外泌体；
通过不同RCF和温度区分普通血浆蛋白和血小板来源微粒，便于检测血栓相关微粒指标。
梯度离心（深度分级）
适用于研究血栓成分中纤溶酶原活化物、纤维蛋白微丝体或血小板-纤维蛋白复合物；
常用70%、50%蔗糖梯度或Percoll等密度介质，4 000×g，30 min，4℃；
通过密度差异在管内形成分层，精确分离靶向复合物层，提高检测灵敏度。
五、离心机参数与校准
转速与RCF换算
根据离心管型号和转子半径，计算所需RCF（×g）并换算为RPM；
离心机面板RPM显示与实际RCF应定期校准，误差≤±5%。
时间控制与刹车模式
设定适当刹车（缓停或自由停止）方式：缓停可减少梯度紊乱，自由停止适合常规血浆分层；
离心时间要充分考虑样本类型和靶标富集需求，避免过度离心导致目标成分沉降在深层。
温度控制
血小板或蛋白组分易受温度影响而聚集或失活，建议在4℃条件下进行微粒体富集和蛋白复合物分离；
定期对离心机制冷系统进行氟利昂充填和温度校准，误差应≤±1℃。
六、血栓成分富集与回收
上清液回收
使用低吸附移液器和滤头，倾斜角度≤30°，贴壁移取上清，避免扰动细胞层；
回收体积控制在血浆总体积的80%以下，剩余样本留于管底防止细胞层污染。
血小板微粒与外泌体
第二步离心后管底常形成白色血小板微粒团，轻叩管壁使其松散；
使用细口吸头、小心移取微粒悬浮液，并按下游检测需求稀释或复离心。
纤维蛋白复合物
梯度离心后靶带通常在中间层，回收后加入等体积缓冲液稀释，并再次250 ×g、5 min去除残余细胞。
七、质量控制与评估
回收率与纯度检测
回收血浆蛋白总量可通过BCA或Bradford法定量；血小板微粒数量和大小分布可通过流式细胞术或纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估；
对照标准品或内标（如荧光微珠），计算分离效率与纯度。
样本稳态监测
在处理前后分别检测D-二聚体、纤溶活性及血小板激活标志物（如P-选择素），评估离心过程是否引入人工激活或损失；
若发现较大差异，需优化离心条件或抗凝剂配比。
重复性与可重复性
同一批次样本平行处理3份，比较回收量、检测值的一致性，评估操作规范性与设备稳定性；
定期在质控样本上进行方法验证，控制变异系数（CV）≤10%。
八、与下游检测的衔接
分数取样与浓缩
对低丰度血栓标志物，回收后可采用超滤装置（3 kDa或30 kDa截留）进行浓缩，提升检测灵敏度；
浓缩结束再低速离心去除滤膜残留，确保样本纯净。
标本保存
回收液立即分装于低吸附管中，−80℃冷冻保存，防止反复冻融；
血小板微粒和外泌体可加入0.1% BSA或蛋白酶抑制剂，保护膜结构和蛋白活性。
检测平台对接
血栓相关指标常用ELISA、免疫透射比浊、流式细胞术、质谱和PCR等技术，样本制备应满足各平台的输入要求；
离心处理细节需在方法学中明确记录，保证实验室间和多中心研究的可对比性。
九、安全与合规
生物安全防护
血栓检测样本为人体血液，需在生物安全二级（BSL-2）实验室操作；
离心机应置于生物安全柜或配备吸附罩，操作时佩戴防护手套、面屏和实验服。
废弃物处理
离心后的废液与一次性移液器头、手套等按医疗废物分类，使用专用红色袋高压灭菌后处理；
离心管、转子室若有污染，需用0.5%次氯酸镁或70%酒精消毒30 min后清洗。
文档与追溯
每次样本处理应填写《血栓检测离心记录表》，记录样本编号、抗凝剂批次、离心机编号、参数设置、操作者及时间；
建立LIMS追溯，确保每个临床样本处理过程可追溯与问责。
十、总结
离心机在血栓检测样本处理中的关键作用不仅体现在样本分层与富集效率，更关乎检测结果的准确性和可重复性。通过严格的采集规范、科学的预处理方案、精确的离心参数设定及严谨的质量控制，能够最大限度地减少样本损失与人工干扰，为临床诊断与科研提供可靠、可重复的血栓检测样本。未来随着微流控、数字化在线监测及自动化技术的发展，离心机在血栓检测中的应用将更加智能化、高通量与标准化，进一步提升血栓及凝血疾病诊断水平。
