一、引言
单细胞测序（Single-cell sequencing）凭借能够解析组织中每个细胞的基因组、转录组或表观遗传组异质性，成为生物医学研究的革命性工具。与传统批量测序相比，它对样本的纯度、完整性和活性要求极高。在整个样本制备流程中，离心分离技术以其简便、高效、可控的特点，承担着从组织或细胞悬液中去除碎片、富集目标细胞、剔除死细胞和杂质的核心任务。合理的离心方案不仅能最大限度地提高细胞存活率和核酸质量，还可显著降低双细胞或碎片污染对测序数据的影响。
二、样本制备流程中的离心角色
组织匀浆与粗过滤
将新鲜或冷冻组织以酶消化或机械研磨方式制备成细胞悬液后，首先通过40–100 μm细胞筛网去除大块碎片。随后在低速（300–500 g）条件下短时间离心（3–5 分钟），去除未消化组织和细胞团，同时保持大部分活细胞悬浮于上清。离心重悬与缓冲置换
经粗过滤的细胞悬液需反复使用PBS或特定缓冲液（含BSA或EDTA）重悬，以清除血红蛋白、脂质体等污染物。典型操作为每次以300–400 g离心5 分钟，将细胞沉淀后弃上清，并轻柔吹打重悬，最多2–3次循环即可达到所需纯度。密度梯度离心富集
对于来源复杂或细胞类型多样的样本，可采用Percoll、Ficoll 或 OptiPrep 等密度介质进行梯度分离。将细胞悬液缓缓叠加于预先配制的密度梯度层上，以400–600 g离心20–30 分钟（无刹车），通过不同层次间的界面收集目标细胞群。该步骤可有效剔除死细胞、细胞碎片以及红细胞等非目标成分。死活细胞剔除
通过台盼蓝染色计数或流式染色（如Propidium Iodide）判断存活率。若死细胞比例超标（>10%），可使用磁珠标记（Dead Cell Removal Kit）结合离心柱或微柱，以免影响后续微流控芯片中单细胞捕获效率。单细胞微流控芯片准备
常见单细胞包裹技术如10x Genomics Chromium、Drop-seq或InDrop均要求输入高纯度、低黏度的单细胞悬液，粒径集中在10–30 μm，且不含大颗粒或双细胞团聚体。此时需最后一次低速离心（200–300 g，3 分钟）去除气泡和浮游杂质，以保证芯片通道不被堵塞。
三、离心参数优化
离心力（RCF）与时间
离心力与时间需平衡沉降效率与细胞损伤。一般低速（100–300 × g）用于细胞回收，高速（>1 000 × g）则适合核酸或质粒提取场景。对单细胞测序样本，推荐300–500 × g、3–5 分钟；密度梯度时可调至400–600 × g、20–30 分钟，并严格禁止刹车，以免扰动界面。温度控制
过高温度会加速细胞代谢与死亡；过低温度则可能诱发冷休克。理想范围在4 ℃左右，全程使用预冷过的离心管和转子，并在4 ℃离心机中操作，保证细胞活力和RNA完整性。管子选择与装载
采用低附着塑料（如低吸附离心管）或表面涂层管，减少细胞与管壁的黏附损失。装载时注意平衡配对，每管量不应超过管容量的80%，以确保平稳运行，避免不必要的振动及剪切力。缓冲液成分
通常使用含0.04% BSA的PBS或HBSS，避免EDTA浓度过高影响细胞膜蛋白。对于神经细胞或浮游表皮细胞样本，可添加0.5–1 mM Ca²⁺/Mg²⁺以维持细胞完整性。
四、典型案例分析
1. 胰岛细胞群体分析
某研究在小鼠胰腺组织中分离胰岛β细胞以研究基因表达差异。先用胰酶消化后，通过100 μm滤网过滤，再以300 × g离心5 分钟去除碎屑；接着在密度梯度介质中以500 × g离心25 分钟收集界面细胞；最后低速200 × g离心3 分钟后获得高纯度单细胞悬液，上机捕获效率达85%，下游测序获得高质量数据。
2. 外周血单核细胞（PBMC）
采用Ficoll-Paque法分离人类外周血中PBMC，常规做法为1 000 × g离心30 分钟（刹车关闭），收集白细胞层，随后以400 × g离心10 分钟洗涤两次。该流程中离心条件严格控制界面清晰度和细胞活率，最终在10x Genomics平台捕获单细胞率大于90%。
3. 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
肿瘤组织经消化后，采用Percoll两步密度梯度（40%/80%），以600 × g离心30 分钟后分别收集两种浓度层面，富集TIL。同时进行低速洗涤以去除残余酶液。此法有效提高了稀有细胞的检测灵敏度，适用于微环境研究。
五、离心技术与微流控结合
预富集与前处理
离心分离为微流控芯片提供清洁、均一的细胞悬液。减少堵塞风险，提高包裹效率。动态在线离心
新型仪器将微流控和微离心集成，通过微流通道内的旋涡与离心效应实现实时细胞分选，无需传统管式离心。该方法减少操作步骤并可自动化，适合高通量筛选。微球标记
离心可与免疫微球法结合：通过磁珠或荧光微球标记特定细胞后，磁离心或差速离心分别富集目标亚群，增强单细胞测序的靶向性。
六、优势与挑战
优势
操作简单、成本低、易于规模化；
对细胞损伤可控，可在短时间内处理大体积样本；
与多种富集方法兼容，提高样本纯度。
挑战
离心剪切力与振动可能导致部分敏感细胞损伤；
梯度介质成本与配制复杂度增加整体耗时；
对超微量样本（<10 μL）处理能力有限，需要微流控或数字微流体替代。
七、未来发展方向
微型化与集成化
开发微离心芯片，实现“上样—离心—分选”一步完成，适合稀少或珍贵样本。智能化参数优化
结合在线传感器（浊度、电导、光散射），通过算法实时调整离心力和时间，实现精细化控制。生物兼容性材料
采用低剪切、高生物相容性材料制成的离心转子和消耗品，减少对细胞膜的机械损伤。多维联合分选
将离心与声学、光学分选方法整合，在同一设备内完成密度、大小与表面标记的多重筛选。
八、结语
离心分离技术作为单细胞测序样本制备的基石，以其灵活、高效、可扩展的优势，确保样本质量和数据可靠性。未来随着微流控、智能化控制和新材料的引入，离心分离将在更小尺度、更高通量及更精细的应用场景中发挥更大作用，为解析生命异质性提供更坚实的技术保障。
