离心机在核酸测序前处理？
一、引言
在高通量核酸测序（NGS）技术日益普及的当下，从样品到文库构建的每一步都需精细把控，离心机在其中发挥了极其重要的作用。无论是组织或细胞的裂解、核酸的富集与沉淀，还是杂质的去除与片段大小选配，台式离心机和超速离心机都成为了核酸测序前处理不可或缺的核心设备。本文将从样品准备、裂解与匀浆、粗提、纯化、富集、浓缩、片段筛选到质量检测，全流程剖析离心机的应用细节与优化策略。
二、样品采集与保存
样品类型：血液、组织、细胞培养物、环境样品（如土壤、污水）等。
采集容器：一次性无RNA酶／DNA酶低吸附离心管，推荐使用DNase-/RNase-free塑料；体积按下游提取试剂盒要求准备（0.5–2 mL微量管或15–50 mL锥形管）。
冷链运输：采后立即放入冰盒（4 ℃）或液氮（–196 ℃）条件下保存，避免核酸降解。采集现场应配备便携式离心机进行预离心去除细胞碎片。
三、细胞／组织裂解与匀浆
裂解缓冲配方：常用含SDS、Triton X-100或CTAB的裂解液，兼顾抑制核酸酶活性。
离心机应用：
低速预离心（500–1 000 × g，3–5 min）：裂解后第一步去除大块细胞核膜和细胞碎片；
中速离心（3 000–5 000 × g，5–10 min）：分离细胞核与线粒体等亚细胞器，为后续纯化减少干扰。
匀浆方式：
手动玻璃匀浆：需先用低速离心去除大块组织，再在管中进行均质；
机械匀浆器：配合离心机进行间歇式匀浆，裂解效率更高，操作时间更短。
四、粗提与蛋白去除
酚／氯仿抽提：裂解液与等体积酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）混合，颠倒样品管10次后室温离心（12 000 × g，10 min），上清含核酸。
蛋白沉淀：上清转入新管，加入三氯乙酸或LiCl，使蛋白质沉淀；中速离心（10 000 × g，10 min）后弃去沉淀。
洗涤步骤：对核酸上清再加等体积异丙醇沉淀，低温（–20 ℃）孵育10 min，离心（12 000 × g，10 min）收集核酸沉淀，并用70%乙醇洗涤2次。
五、柱式或磁珠纯化
柱式纯化：
将裂解产物与结合缓冲混合，上柱后离心（8 000 × g，1 min）使DNA/RNA结合于硅胶膜；
洗涤缓冲经过2–3次离心去除杂质；
最后用低盐缓冲或水洗脱（10 000 × g，1 min），即可获得纯净核酸。
磁珠纯化：
在结合缓冲中加入磁珠，轻轻混匀后中速离心（或直接磁分离）回收磁珠；
用洗脱缓冲洗涤2–3次，每次均可借助磁架快速分层，无需离心；
最后加入洗脱液，室温孵育5 min，再次磁分离获得纯化核酸。
六、核酸浓缩与去盐
乙醇／乙酸钠沉淀：如提取量稀时，常用0.1体积 3 M醋酸钠和2.5体积乙醇沉淀核酸，–20 ℃或–80 ℃离心（12 000–16 000 × g，15 min），有效去除高浓度盐离子。
真空浓缩：高通量实验室可将洗脱产物置于真空浓缩仪中，离心浓缩结合加热模式，缩短时间且不影响产率。
超滤浓缩：通过分子量截留（MWCO）分离管，在低速或无离心状态下进行快速浓缩，兼具去盐功能。
七、片段大小筛选与文库构建
双节段磁珠法：利用不同体积比（例如0.8× 、1.2×）的磁珠结合与洗脱，去除小于200 bp和大于1 kb的片段，实现目标区间富集；
梯度离心／密度梯度法：在台式超速离心机（50 000–100 000 × g）中，以蔗糖或CsCl形成密度梯度，分层回收特定大小的DNA环状体；
文库连接前检查：用Qubit或PicoGreen定量、Agilent Bioanalyzer检测片段分布，确保下一步接头连接效率与测序通量。
八、去除PCR抑制物与污染控制
多孔膜过滤结合低速离心（2 000 × g，1 min）可去除大分子抑制物；
DNase/RNase消除：在纯化后适当添加DNase（RNA测序）或RNase（DNA测序），37 ℃孵育后再离心去除核酸酶与降解产物；
全程使用灭菌离心管与滤芯吸头，定期对离心机腔体及转子进行紫外照射灭菌，杜绝交叉污染。
九、质量检测与流程优化
浓度与纯度：
NanoDrop 测定A₂₆₀/A₂₈₀与A₂₆₀/A₂₃₀比值，前者反映蛋白污染，后者指示有机物或盐离子残留；
Qubit 或荧光染料定量，保证上机文库浓度精确。
片段分布：Agilent 2100 Bioanalyzer或TapeStation检测文库片段与文库大小分布，确保目标范围覆盖度（如150–500 bp）。
流程优化：
对不同样品类型设定不同离心力与时间组合，并通过对照实验优化；
定期维护离心机，校准转速与温控，保持离心力准确性；
建立SOP与批次记录，统计回收率与测序数据质量（Q30、重复序列率），持续反馈改进。
十、结语
离心机在核酸测序前处理流程中承担了裂解后去除细胞碎片、蛋白质沉降、核酸富集与洗脱、片段大小筛选以及去盐浓缩等多重关键任务。通过精确控制离心力、时间与温度，并结合柱式／磁珠纯化、双节段磁珠法与梯度离心等技术，研发人员可在高通量测序前获得高质量、高纯度且分布均匀的核酸样品。未来，随着微流控集成离心设备、自动化文库构建系统与智能化质量控制平台的不断成熟，离心机的应用将更为多元与高效，为精准测序与个性化医学提供更加坚实的样品保障。
