一、引言
蛋白组学作为研究细胞、组织乃至个体蛋白质表达谱、修饰状态和功能网络的重要学科，广泛应用于疾病机制研究、生物标志物发现和新药研发等前沿领域。在整个蛋白组学流程中，样本的前处理至关重要，直接影响下游质谱分析的结果准确性与重复性。离心作为样本预处理的核心技术之一，通过其高效分离与浓缩能力，能有效去除杂质、富集目标组分并保护蛋白结构不被破坏。本文将系统阐述台式离心机在蛋白组学样本前处理中的应用场景、关键参数、设备选择、操作规范及优化策略。
二、蛋白组学样本的主要类型及离心目标
蛋白组学研究涉及多种样本类型，不同来源和目的的样本其离心目标有所不同：
| 样本类型 | 主要处理目标 | 离心目的与作用 |
|---|---|---|
| 细胞裂解液 | 去除细胞碎片、胞核、未溶解残渣 | 澄清、净化 |
| 血浆 / 血清 | 除去脂质体、细胞外囊泡、沉淀蛋白 | 澄清、浓缩 |
| 组织匀浆 | 清除组织残渣、脂肪层、非蛋白颗粒 | 分层、去脂、初步富集 |
| 细胞培养上清 | 回收分泌蛋白、外泌体、胞外囊泡 | 浓缩、纯化 |
| 尿液、脑脊液等 | 去除上清中的细胞、脱落片段、盐及蛋白酶等抑制物 | 预清洗、富集 |
在上述样本的制备流程中，离心可配合过滤、透析、沉淀、蛋白提取剂等手段共同使用，确保蛋白提取质量高、重复性强。
三、主要离心步骤与参数设定
1. 初步清除细胞碎片和残渣
操作目的：去除细胞核、膜碎片、未裂解组织块，防止下游分析受到干扰。
推荐参数：
RCF：800–2,000 ×g
时间：5–10 min
温度：4 ℃
转子类型：固定角转子或水平转子均可
说明：离心后沉淀为非溶性物质（保留上清）；如处理组织样本，应先进行匀浆、冷冻再离心。
2. 蛋白粗富集或前期浓缩
操作目的：沉淀或浓缩低丰度蛋白，提高后续检测灵敏度。
推荐参数：
RCF：10,000–14,000 ×g
时间：10–20 min
温度：4 ℃
配合处理：与TCA沉淀、甲醇-氯仿法或蛋白富集试剂联用
说明：此步骤可沉淀小分子蛋白与膜蛋白，但同时也可能沉淀杂质，需注意洗涤和重悬。
3. 去脂与外泌体初步分离
操作目的：分离脂肪层或回收细胞外囊泡。
推荐参数：
RCF：8,000–12,000 ×g
时间：15–30 min
温度：4 ℃
补充手段：结合密度梯度离心（蔗糖/Percoll）
说明：适用于外泌体蛋白研究，需保证转子类型为超速耐压型。
4. 清除蛋白酶与抑制因子
操作目的：在蛋白溶解液中移除蛋白酶、核酸酶、盐等干扰成分。
推荐参数：
RCF：10,000–14,000 ×g
时间：5–10 min
温度：4 ℃
方法：使用超滤离心管（3kDa–30kDa截断分子量）
说明：蛋白超滤不仅可清除小分子杂质，还可进行缓冲液置换（buffer exchange）。
四、离心设备与耗材的选择
1. 台式离心机配置要求
最大转速：≥14,000 rpm
最大RCF：≥20,000 ×g
温控功能：0–40 ℃可调，冷却效率快（≤5 min降至4 ℃）
振动控制：运行时振幅≤0.1 mm，避免样品扰动
噪声控制：≤55 dB(A)，适应实验室环境
2. 转子与适配器
微量管转子：用于1.5/2 mL微管；倾角30°–45°固定角型优先
超速适配器：支持0.2–0.5 mL管，适合处理低体积高浓缩样本
超滤离心管适配器：适配Amicon、Vivaspin等品牌离心管
水平转子：配合外泌体、胞外囊泡、组织样本分层处理使用
3. 离心耗材
微量管：采用DNA/RNA无酶认证产品，具抗裂、耐有机溶剂能力
滤器／超滤芯：依据目标分子量选择合适截断孔径（MWCO）
一次性适配器：减少污染风险，便于样本间分离操作
五、操作流程中的关键点
1. 温度控制
整个离心过程应始终保持在4 ℃左右，避免热敏蛋白降解；离心机应提前预冷。
转子与离心管预冷10–15 min后再加样；避免温度梯度造成样品结露或损伤。
2. 平衡原则
每次离心前确保试管配对、质量基本一致（误差≤0.01 g）；避免不平衡引起振动和转子损坏。
3. 样品封闭
样本应封管严密；对于有潜在生物危害的样品（如临床组织、血液），推荐密封转子与气溶胶保护帽。
4. 操作节奏
每次离心后应静置1–2 min再开盖，以避免气溶胶扰动。
对沉淀的蛋白小心取上清，避免扰动沉淀带。
六、结合其他技术的协同使用
| 离心 + 方法 | 主要目的 | 效果描述 |
|---|---|---|
| 离心 + TCA沉淀 | 富集总蛋白，沉淀小分子蛋白 | 高回收率，但需多次洗涤以去除酸性背景 |
| 离心 + 透析袋或超滤 | 清除盐、缓冲物，浓缩蛋白质 | 准确控制目标蛋白浓度，适合质谱或Western样品准备 |
| 离心 + 蔗糖梯度 | 分离胞外囊泡、膜蛋白 | 准确控制密度分层，有助于目标蛋白纯度提高 |
| 离心 +磁珠沉淀 | 靶向分离磷酸化/泛素化蛋白等特定修饰种群 | 富集特异性蛋白，提高质谱检测概率 |
七、常见问题与优化建议
| 问题 | 可能原因 | 解决策略 |
|---|---|---|
| 沉淀松散、蛋白回收率低 | 离心力不够 / 时间不足 / 超滤管未预润滑 | 提高RCF至10,000 ×g以上，延长时间，使用低吸附离心管 |
| 上清混浊、蛋白被污染 | 上清回收时扰动沉淀 / 温度波动导致降解 | 回收前静置1–2 min，4 ℃操作，全程使用蛋白酶抑制剂 |
| 样品粘管 / 管壁挂样 | 蛋白浓度过高或聚集，未使用低吸附管 | 更换防吸附微量管，添加0.01% NP-40或Tween-20轻度缓冲 |
| 离心管裂裂或漏液 | 超速条件下管材不匹配，密封盖未拧紧 | 使用耐高速认证微管，运行前检查密封性 |
| 下游质谱分析干扰（如离子抑制） | 盐未清除 / 洗脱剂中含DEPC或SDS | 加超滤离心脱盐步骤，避免含有强离子型试剂 |
八、蛋白质样本前处理典型工作流整合（示例）
样本来源：细胞裂解液，目标为全蛋白组质谱分析
冰上裂解 → 离心（1,000 ×g，5 min）去核 →
上清富集蛋白 → 离心（14,000 ×g，15 min） →
上清用TCA/乙醇沉淀 → 再次离心 →
重悬于蛋白溶解液（8 M Urea） →
超滤管（10kDa）透析去盐缓冲 →
BCA定量 → 胰蛋白酶消化 → 质谱上样
九、总结
离心技术贯穿蛋白组学样本前处理全流程，是去除杂质、富集蛋白、保护样本活性的重要手段。通过选择合适的离心设备、适配器与运行参数，结合高效的样品处理策略，可大幅提升蛋白提取的质量与重复性，为下游质谱分析打下坚实基础。建议实验室结合样本类型、研究目标与设备能力，建立标准化SOP并持续优化，从而确保蛋白组学研究成果的准确性与可靠性。
