一、概述与目标

细胞裂解物中含有细胞核、线粒体、内质网、细胞质溶胶、膜囊泡及可溶性蛋白等多种组分。离心分离是利用不同组分在离心力场中沉降速率差异，实现分离纯化的经典方法。合理的离心策略能够高效富集目标亚细胞器或蛋白复合物，为后续蛋白组学、酶学分析、亚细胞定位及结构研究奠定基础。

本文旨在系统梳理从样本制备到梯度优化的全流程策略，包括裂解方法、离心类型选择、参数优化、梯度介质应用、常见故障及解决方案，为科研人员提供实践指导。

二、样本制备与前处理

2.1 裂解缓冲液配制

• 成分选择：缓冲盐（如HEPES、Tris）维持pH稳定，选择合适NaCl浓度（通常150 mM），添加EDTA或EGTA螯合二价金属离子，减少核酸酶活性；可根据需要添加NP-40、Triton X-100或CHAPS等非离子/两性界面活性剂，促使细胞膜破裂而保持细胞器完整。

• 防护试剂：加入蛋白酶抑制剂（PMSF、AEBSF、EDTA-free混合片）及磷酸酶抑制剂，抑制蛋白降解与去磷酸化。

2.2 机械与化学裂解结合

• 超声破碎：利用超声探头或水浴超声，在冰浴条件下短时（5–10 s×3次）破碎，间隔冷却，减少热损伤。

• 匀浆器：玻璃-Teflon匀浆或高压均质，适合大体积样本；注意预先冰镇器具，操作速度适中避免泡沫产生。

• 酶消化：低温使用溶菌酶、胰蛋白酶等辅助打破细胞壁（真菌、植物），结合机械力提高裂解效率。

2.3 去除细胞碎片

裂解后原液需先做低速离心（500–1 000 × g，5–10 分钟），去除未破碎细胞及大块碎片，上清即为粗裂解液，随后进入精细分离阶段。

三、差速离心策略

3.1 多阶段离心流程

1. 第一次低速：500–1 000 × g，5–10 分钟，去除细胞核及大碎片。

2. 第二次中速：10 000–12 000 × g，10–20 分钟，富集线粒体、溶酶体及大胞器。

3. 第三次高速：100 000–120 000 × g，30–60 分钟，分离微粒体（内质网、膜囊泡）和可溶性蛋白。

3.2 离心力与时间平衡

• 离心力（RCF）与时间呈反比关系：RCF越高，用时越短；但过高RCF或过长时间均可引起亚细胞器破裂或二次聚集，影响纯度。

• 建议先测试梯度条件：可在梯度管中做小规模试验，以确定最佳RCF和保持结构完整的最大时间。

3.3 转子与管型选择

• 角转子：沉降路径短，速度快，适合大多数差速离心；但管壁受力较大，小心管子破裂。

• 沉降转子：管子保持垂直位置，沉降距离较长，但分辨率高，适用于需要更精细分离的阶段。

• 管材要求：根据RCF选择聚丙烯或聚碳酸酯管，标注最大离心力，避免使用玻璃管。

四、密度梯度离心策略

4.1 梯度介质类型

• 蔗糖梯度：常用10–60%（w/v）蔗糖缓冲液，操作简便；但梯度稳定性差、粘度高，影响操作。

• Percoll梯度：硅胶颗粒介质，低粘度，离心后易回收；适合保持细胞器活性。

• OptiPrep（碘苷酸钡）：等渗梯度介质，无毒，适合对活性要求高的酶学研究。

4.2 梯度构建方式

• 连续梯度：通过梯度生成器或多通道灌注器缓慢分层，适合线性分离。

• 阶梯梯度：预先配制若干浓度层次，管壁内缓缓叠加，形成大致分界；操作相对简单，适合快速分离。

4.3 应用示例

• 线粒体纯化：利用Percoll连续梯度（15–30%），15 000 × g离心30分钟（无刹车），在界面收集线粒体，纯度和活性均较差速离心显著提升。

• 细胞核分离：蔗糖阶梯梯度（30%、50%、80%），1 000 × g预离心后进入梯度，20 000 × g离心1小时，收集不同层次以得到纯核和核膜碎片。

五、超速离心与膜囊泡分离

5.1 条件设定

• RCF：100 000–200 000 × g；

• 时间：1–2 小时，根据膜囊泡大小和密度调整；

• 温度：4 ℃全程，保护蛋白活性。

5.2 小泡与外泌体

• 初步清洗：在10 000–12 000 × g离心20分钟去除大颗粒；

• 超速离心：100 000 × g，70分钟，收集沉淀即为小泡/外泌体；

• 洗涤：沉淀重悬于PBS，再次100 000 × g离心30分钟，去除游离蛋白及杂质。

5.3 密度浮选

将小泡悬浮于密度介质（如OptiPrep 5–40%），100 000 × g离心16小时，分离出不同密度层次的小泡亚群，进一步提升分离纯度与特异性。

六、参数优化与质量控制

6.1 监测手段

• 电镜观察：对分离产物形态进行透射电镜或扫描电镜检查；

• 膜蛋白标记：Western blot检测细胞器特异性标记（如COX IV、LAMP1、Calnexin）；

• 酶学活性：测定线粒体琥珀酸脱氢酶活性、溶酶体酸性磷酸酶活性；

• 颗粒大小分析：动态光散射（DLS）或纳米跟踪分析（NTA）。

6.2 常见问题及解决

• 管壁粘附：更换低附着材料或预先用BSA封闭；

• 样本丢失：减少吸取次数，使用移液器留少量缓冲；

• 分层不清：检查缓冲液密度配比，缓慢加载梯度层；

• 过度剪切：适当降低转速或缩短时间，改用更温和的破碎方法。

七、自动化与规模化

7.1 连续流离心

采用连续流离心机，大量生物工艺中用于分离细胞与胞外分泌产物，可与在线取样及在线检测结合，提高通量与重复性。

7.2 半自动梯度生成

市售梯度生成器配合可编程泵，可准确、可重复地构建梯度，减少人为误差，适合高通量实验室。

八、结合其他分离技术

• 免疫磁珠法：先行离心除杂，再用磁珠富集靶蛋白复合物；

• 超滤浓缩：离心后上清通过膜过滤器浓缩，再进行梯度分离，提高效率；

• 色谱联用：离心分离后对目标组分进行凝胶过滤或离子交换层析，进一步纯化。

九、实际应用案例

1. 线粒体蛋白复合物研究
   通过Percoll梯度精制线粒体，在后续质谱分析中鉴定呼吸链超复合物，获得高覆盖率蛋白谱。

2. 外泌体标志物筛选
   在肿瘤细胞培养上清中分离外泌体，结合免疫电镜和蛋白芯片，鉴定出多种潜在诊断标志物。

十、小结与展望

离心技术对细胞裂解物分离过程中的作用至关重要。通过差速离心、密度梯度与超速离心相互配合，并结合合适的裂解条件与质量监测，可高效分离并富集不同亚细胞组分。未来，随着微流控集成离心、智能化自动化平台以及新型介质的应用，离心策略将在精准分离、多组分联合富集及高通量分析中发挥更大潜力，为细胞生物学和生物制药研究提供更加可靠的技术支持。