一、原理概述
密度梯度离心依赖于在离心场作用下，不同密度颗粒沿梯度介质分层聚集。蔗糖梯度属连续或不连续梯度，密度范围0.2–2.0 g/mL，可分离细胞器、病毒、核酸复合物；Percoll梯度因粒径均一、渗透性低，适合活细胞、亚细胞组分分离。关键在于控制梯度形貌、离心g值和时间，以实现目标组分的最佳分辨率。

二、梯度介质制备

1. 蔗糖梯度

• 配制母液：称取蔗糖并溶于缓冲液（如TNE缓冲液：10 mM Tris-HCl pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA），制得1.8–2.0 g/mL母液，过滤灭菌。

• 梯度构建：连续梯度使用梯度发生器或慢速移液器形成5%–60%（w/v）梯度；不连续梯度常设三层，如20%、40%、60%，每层体积根据管型定（例如SW-41转子10 mL管，每层3 mL）。

1. Percoll梯度

• 配制等渗Percoll：将Percoll与2.5 M硯氯化钾缓冲液（HBSS或PBS）按9∶1混合，调整至290 mOsm/kg，pH 7.2。

• 梯度类型：连续梯度可用梯度发生器制得10%–80%梯度；不连续梯度可按30%、50%、70%分层，每层体积3–5 mL。

三、仪器与试剂

• 台式离心机：须配备可调速度的水平或固定角转子，常用转子如JLA-10.500、F45-6-30。

• 温控：多数生物样品推荐4 ℃离心，须启用制冷功能，防止热敏组分失活。

• 防震装置：定期校准转子平衡，保证≤0.1 mm振动幅度。

• 其他：移液器、微量移液器、渐开线胶头、5 mL刻度离心管、pH试纸或pH计。

四、参数选择与优化

1. g值与转速

• 蔗糖梯度：一般设定1.5–3.0 ×10^4 g；Percoll梯度：0.5–2.0 ×10^4 g。

• 转速换算：以转子半径计算g值（g=1.118×10^-5×R×(rpm)^2），确保所需g力与转速匹配。

• 优化策略：先以中等g值（1.0 ×10^4 g）预试，观察分层清晰度，再微调±2 ×10^3 g。

1. 离心时间

• 蔗糖梯度：常用1–3 h；Percoll梯度：20–60 min。

• 时间过短：分层不明、峰扩散；过长：目标区带扩散、背景噪声增加。

• 推荐：依目标粒径与密度差异设定，预实验中每次±10 min试验。

1. 温度控制

• 生物样品应4 ℃操作，避免蛋白酶活性；非生物大分子如病毒可室温。

• 样本总冷链：梯度介质、样本预冷（4 ℃离心机内或冰盒）。

1. 样本体积与负载

• 每管负载量不超过管容量的60%，以保留足够缓冲层减少扰动。

• 样本黏度大时可预稀释或加入BSA（0.1%–1%）降低非特异吸附。

五、样本预处理

• 细胞破碎：使用细胞匀浆器或超声，以缓冲液匀浆，离心去除细胞核及残渣（1 000 g，10 min，4 ℃）。

• 上清分装：取上清小心加入梯度管顶端，避免扰动梯度层次。

• 标记步骤：如需荧光、放射性标记，提前于等密缓冲液中标记、洗涤三次后再负载。

六、分层加载与离心

1. 加载方式

• 等体积层次：使用细口移液管缓慢置入；连续梯度则从最密端注入低密度溶液，以减少界面湍流。

• 样品置于最上层，或与最低密度组分混合后置顶。

1. 离心操作

• 先低速（1 000 g，1 min）预平衡，检查密封状况；

• 再快速启动至目标转速，避免电机过载；

• 结束后静置3 min，让微扰平复，再慢速卸压。

七、分层收集与分析

1. 收集方法

• 手动抽吸：在层间可见明显色带，用长针管自上而下分段抽取，每段体积0.5–1 mL；

• 自动分层采集器：配合管底穿刺，精确采集。

1. 分析鉴定

• 密度测定：每段测定密度（阿基米德原理或折光仪）；

• 活性/含量测定：如蛋白含量（BCA法）、酶活（底物法）、核酸浓度（A260）或流式细胞分选。

八、参数优化案例

1. 细胞器分离

• 目标：线粒体（ρ ≈ 1.18 g/mL）与溶酶体（ρ ≈ 1.12 g/mL）分离，采用30%–60%蔗糖梯度，2 ×10^4 g，2 h，4 ℃，得线粒体峰位于40%–50%层间。

• 优化：减少时间至1.5 h可提高纯度；增加BSA至0.5%减少黏附。

1. 病毒纯化

• 目标：腺病毒（ρ ≈ 1.34 g/mL），使用连续Percoll梯度（25%–60%），1 ×10^4 g，30 min，室温，得到明显白色带。

• 优化：室温减少至22 ℃可降低病毒聚集；加入0.01%吐温-20减少非特异黏附。

九、常见问题及对策

• 梯度层次混乱：可能注液过快或样本体积过大。应降低移液速度、减小层间体积。

• 分层不明显：说明g值或时间不足，可适当提升至1.2–1.5倍，或延长20–30 min。

• 背景杂带：介质离心后出现不规则杂带，多为非特异蛋白或核酸污染，需在梯度前预清洗样本并使用复性缓冲洗涤。

十、安全与废液处理

• 废液含蔗糖、Percoll应进行生化降解或化学中和；高浓度蔗糖梯度可稀释至<5%后排入下水道。

• 操作全程佩戴防护，避免Percoll吸入或皮肤接触，废管、吸头统一高压灭菌后回收。

十一、质量控制

• 每批梯度制备均需测定密度曲线（折光计或密度计），保证梯度线性或预期层次。

• 定期校准离心机g值与温度，保持误差≤5%。

• 使用内标（如荧光标记微球）实时监测分层精度。

十二、总结与建议
密度梯度离心的成功依赖于梯度制备均匀度、精确的g值/时间控制以及样本前处理规范。对不同目标组分，需反复预实验优化参数——从梯度范围、离心力、时间、温度及样本量多维度调整。结合自动分层和高灵敏分析方法，可最大化分离纯度与回收率，满足科研和生产需求。