一、交叉污染的定义与分类

1.1 什么是交叉污染？

交叉污染，指的是在一个共享的培养环境中，不同实验材料之间因直接或间接接触而发生的微生物、细胞或分子污染，导致实验结果混乱或样本丢失。

1.2 常见交叉污染类型

1. 细胞系交叉污染：如HeLa细胞侵染其他细胞株。

2. 微生物污染：细菌、真菌、支原体等微生物在箱内传播。

3. 气溶胶传播：气溶胶中带有污染因子，可漂浮在箱体内部。

4. 接触性传播：通过培养皿外壁、手套、货架或湿度盘传播。

5. 气流污染：空气循环不当使污染物在箱内扩散。

二、交叉污染的主要传播途径

2.1 直接接触传播

• 实验者使用同一镊子或吸头在不同培养物间操作；

• 培养器皿外壁有残留液体，与其他样品接触；

• 培养液溢出污染水盘、托盘等公共部位。

2.2 气溶胶与气流传播

• 揭开培养皿盖时，内部液体飞溅产生气溶胶；

• 气体循环风扇将气溶胶扩散至箱体内部各角落；

• CO₂混合不均或过滤装置失效时，污染可随气流扩散。

2.3 操作过程中的人为污染

• 操作手套未更换即取放多个样品；

• 培养箱门长时间打开，室外空气与样品直接接触；

• 操作过程中说话、打喷嚏、咳嗽传播飞沫。

2.4 仪器内部部件污染

• 湿度盘积水未清理，细菌或霉菌滋生；

• 架板、托盘上残留培养液，成为污染源；

• 风扇、加湿器内形成生物膜，持续释放微生物。

三、CO₂培养箱设计对污染控制的支持功能

3.1 HEPA过滤系统

部分高端CO₂培养箱配置高效颗粒空气过滤器（HEPA），能有效去除0.3μm以上颗粒（如微生物、尘埃），保持空气洁净循环。

3.2 独立气流系统

通过箱内风扇进行恒速气体循环，避免气流死角，减少污染堆积区域。部分培养箱设有垂直层流设计，有助污染物排出。

3.3 内腔一体成型设计

不留缝隙、易清洁、不易积水或藏污纳垢；优质不锈钢腔体表面光滑，不利于细菌附着。

3.4 高温湿热灭菌系统

部分型号可自动高温灭菌（如180℃高温循环12小时），有效杀灭箱内微生物残留。

四、防止交叉污染的操作规范

4.1 培养样本管理分区

• 明确样本摆放区域，同类样品集中放置；

• 细胞系、原代细胞、微生物培养须严格分区；

• 建议使用带标签的托盘或色彩编码系统区分。

4.2 规范操作流程

• 操作前洗手并更换一次性手套；

• 每更换样本时用75%酒精擦拭手套；

• 拆盖、滴液等动作靠近培养箱底部完成，避免高处飞溅；

• 开门时间尽量控制在30秒内。

4.3 培养器皿的选择与使用

• 使用滤盖瓶、密封性良好的皿盖，防止气溶胶泄露；

• 不共享瓶盖、管口，不使用共用移液器；

• 每次培养器具前后需进行酒精擦拭处理。

五、培养箱日常清洁与消毒策略

5.1 日常擦拭清洁

• 每周关闭设备，使用70~75%酒精擦拭内壁、搁板、水盘；

• 风扇外罩可拆卸擦拭，严禁带水清洗电气元件。

5.2 湿度盘清洁

• 每周倒空并更换蒸馏水；

• 每月使用漂白剂或过氧化氢浸泡消毒1小时后冲洗干净；

• 不得使用含银离子的杀菌剂，避免沉积。

5.3 高温灭菌或紫外消毒（如配备）

• 使用自带的灭菌程序，或放置紫外线灯每月照射一次；

• 灭菌期间应取出所有细胞材料。

六、多样本共箱培养时的管理策略

6.1 样本信息记录与标识

• 所有样本贴上清晰标签（包括细胞系名称、实验人、接种时间）；

• 采用托盘分类法，将不同实验分托存放；

• 建议设置《箱内样本登记表》，明确每日样本状态。

6.2 样本轮换使用制度

• 不同种类样本尽量错峰放入；

• 周期性安排高污染风险样本集中处理后灭菌设备；

• 设立“低风险样本日”和“清洁日”，保障隔离。

七、特种污染控制措施

7.1 支原体污染防控

支原体污染隐蔽且破坏性大，应采取以下措施：

• 每月使用支原体检测试剂（PCR或荧光染色）筛查样本；

• 支原体阳性样本隔离处理，不得共用设备；

• 定期使用支原体清除剂清洗培养箱内部。

7.2 空气浮游菌控制

• 可在实验室空气中采样检测；

• 如空气菌浓度高，检查通风系统并增加空气过滤设备；

• 建议配备空气质量监测仪器。

八、高标准实验室的额外防护手段

8.1 双门双锁箱体

部分培养箱设计为双门结构，设有观察门与操作门，减少空气交换频率。

8.2 独立舱室结构

高端培养箱可划分多个独立气体模块，即使一个舱室污染也不会蔓延至其他区域。

8.3 实时环境监控系统

使用在线传感器监测温度、湿度、CO₂浓度与VOC污染物浓度，及时发现异常。

九、真实案例分析与经验总结

案例一：HeLa污染HT-29细胞事件

背景：在某高校实验室，同一台CO₂培养箱用于培养HeLa和HT-29细胞。

问题：一个月后HT-29生长异常，经STR鉴定发现为HeLa污染。

原因分析：

• 样本混放，无明确标识；

• 使用同一移液器交替操作；

• 未定期清洁培养箱。

改进措施：

• 建立托盘管理制度；

• 每种细胞设专属吸头盒与移液枪；

• 每月使用高温消毒程序。

十、总结与建议

在共享使用CO₂培养箱的过程中，交叉污染风险无处不在，只有通过科学管理、设备维护与良好操作规程的综合配合，才能实现有效预防。以下是总结性建议：

1. 分区管理：不同实验项目物理隔离。

2. 严控操作：标准化动作流程，规范移液、摆放、记录。

3. 定期清洁：每周清洗、每月灭菌，维护洁净环境。

4. 人员培训：新手上岗必须培训，熟悉防污染守则。

5. 技术升级：配置HEPA、高温灭菌模块提升设备自洁能力。

6. 记录追踪：建立样本日志与污染记录，追溯与问责明确。

随着细胞生物学和精准医学的发展，实验的可靠性和重复性越来越依赖培养环境的无菌性。控制交叉污染不仅是技术问题，更是科研诚信与实验质量保障的体现。