一、前言

酶标仪（Microplate Reader）是一种广泛应用于生物医学、分子生物学、免疫学及药物筛选等领域的仪器设备，主要用于检测微孔板中样品的吸光度（OD值）、荧光或化学发光信号等。为了确保所获得数据的准确性和可重复性，需要评估该仪器在特定实验条件下的检测性能。其中，线性范围（Linear Range）作为关键参数之一，决定了样品浓度与仪器响应信号之间保持线性关系的浓度范围。

二、什么是线性范围

线性范围是指在一定浓度范围内，检测系统的输出信号（如吸光度）与待测物质浓度成正比的区间。这个范围的下限由仪器的检测限决定，上限则由检测信号达到饱和或失线性所限制。在该范围内，实验者可以较为准确地根据信号强度推算出待测物的实际浓度。

三、线性范围测定的意义

1. 确保定量准确性：只有在确定的线性区间内，酶标仪的响应信号才能精确反映样品的实际浓度。

2. 优化实验条件：根据线性范围，可以合理设定样品浓度，避免结果失真。

3. 质量控制：在生物制药及体外诊断领域，验证检测系统的线性范围是方法学验证的必要步骤。

4. 提高重现性与可比性：不同实验间的数据可比性建立在测定系统性能稳定的基础上。

四、测定线性范围的准备工作

1. 仪器准备

• 确保酶标仪功能正常，已进行日常维护与校准；

• 设置合适的波长（常见如450 nm）；

• 预热仪器并进行背景校正。

2. 试剂准备

• 选择具有代表性的待测物质（如标准蛋白质、药物分子、酶底物等）；

• 配制一系列已知浓度的标准溶液，覆盖预期线性区间，如从最低至最高浓度按倍比或等梯度稀释。

3. 反应体系优化

• 设定合适的反应体积（如100 µL）；

• 确保反应底物、缓冲液等稳定，避免干扰因素。

五、测定步骤

1. 标准曲线制备

将已知浓度系列的标准液（如0、5、10、20、40、80、160、320 µg/mL）分别加入微孔板中，每个浓度设置至少3个重复孔，保证统计学有效性。

2. 酶反应执行

• 添加酶或显色底物，使其反应；

• 在规定时间内读取吸光度值（如反应10分钟后测定450 nm OD值）；

• 为避免时间差异影响，建议使用自动加样器和自动读板程序。

3. 数据采集与处理

记录所有孔的吸光度，计算每组的平均值与标准差。将浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

六、线性区间判定方法

1. 线性回归分析

采用线性回归法（如最小二乘法）拟合标准曲线，得到回归方程：
$Y=aX+b$
其中，Y 为吸光度，X 为浓度，a 为斜率，b 为截距。

2. 判定系数（R²）

计算决定系数 R2R^2R2，用于评估回归模型的拟合优度。通常，R² ≥ 0.99 被认为线性良好。

3. 相对误差或偏差分析

评估每个浓度点的预测浓度与理论浓度之间的相对误差。一般认为，相对误差在 ±10% 范围内可以接受。

4. 残差分析

绘制残差图（预测值与实际值的差），观察是否在某个浓度段开始系统性偏离。

5. 选择线性区段

结合以上分析方法，选择从最低浓度到偏离点之前的连续浓度段作为该方法的线性检测范围。

七、影响线性范围的因素

1. 仪器性能：酶标仪的光源稳定性、检测器灵敏度、动态范围直接影响线性结果；

2. 反应体系：底物量不足、反应过快或酶活性太高可导致信号非线性；

3. 样品稀释：高浓度样品应合理稀释，以纳入线性区间；

4. 孔板质量：使用清洁、无划痕、无污染的96孔板，有助于减少背景干扰；

5. 光路设置：单波长与双波长检测模式的选择对背景扣除效果不同；

6. 温度与时间控制：反应时间过短或过长都会影响吸光度值。

八、线性范围验证报告内容

撰写标准验证报告时，应包括以下内容：

• 实验目的；

• 仪器与耗材描述；

• 标准品来源与配制方法；

• 反应条件与读数波长；

• 数据表格与标准曲线图；

• 回归分析结果（含 R²、方程）；

• 线性范围定义及偏差分析；

• 结论及建议；

• 原始数据附录。

九、实例分析（简述）

以检测一种蛋白质为例，通过BCA法测定其浓度，设置0–200 µg/mL浓度梯度，记录如下数据：

从中可看出，200 µg/mL 时误差开始超过10%，说明线性区间应设定为0–160 µg/mL。

十、注意事项与常见问题

• 过高OD值警告：若OD值接近仪器检测上限（如3.0），容易产生非线性；

• 空白孔设置：必须设置空白孔（只含反应体系）用于背景扣除；

• 重复性验证：不同批次标准品应重复测试线性，以验证方法一致性；

• 软件拟合偏差：自动拟合可能掩盖偏离，建议人工判断曲线形态；

• 低浓度灵敏度：检测限附近的信号波动较大，影响线性性判断。

十一、总结

酶标仪检测线性范围的测定是任何基于光学吸收法进行定量分析的基础步骤。科学严谨地执行每一个环节，不仅能保障实验数据的可靠性，还能提升实验室整体检测质量。通过标准曲线法与统计学工具的结合，可以准确界定适用范围，为后续的样品检测和数据解读提供坚实的基础。