一、抗原抗体结合的基础原理

抗原抗体结合属于非共价结合反应，依靠氢键、疏水作用、静电作用和范德华力维系。这种结合具有高亲和力与高度特异性，但同时也表现出一定的可逆性。

特性包括：

• 非共价、可逆：高亲和性不等于不可分离；

• 结合依赖温度与pH：极端条件可能破坏结合稳定性；

• 表面吸附依赖孔板处理：固相ELISA中抗原或抗体固定在高结合力的微孔板上；

• 时间因素明显：需要充足孵育时间实现充分结合。

在ELISA流程中，洗板步骤通常位于抗体结合后的“封闭”、“酶标抗体孵育”、“酶反应”等阶段之间。若清洗过程过于激烈或设置不当，确实可能干扰已经形成的抗原抗体复合物。

二、洗板机的工作机制概述

现代洗板机主要通过如下方式实现清洗：

1. 注液/冲洗：注入洗涤液冲刷孔内未结合物；

2. 震荡/涡旋：部分设备具有震荡功能以强化洗涤；

3. 吸液/抽液：通过负压抽取孔内液体，常采用针头精准控制吸液深度；

4. 重复循环：设定清洗次数、体积和频率以增强洗涤效果。

核心参数包括：

• 冲洗体积（如每孔300 µL）；

• 清洗次数（常见为3-5次）；

• 吸液高度（避免刮伤孔底）；

• 涡旋强度与时间；

• 液体流速与压力。

这些物理行为若不当，理论上可能对抗原抗体复合物构成干扰。

三、洗板过程中可能影响抗原抗体结合的机制分析

1. 高压液体冲击导致机械扰动

如果注液压力过高，或喷嘴设计不合理，可能对吸附在微孔板底部的抗体或抗原造成冲刷。

影响机制：

• 增加表面剪切力，松动结合分子；

• 擦除非牢固吸附的蛋白质层；

• 冲散边缘孔或孔底中央局部区域的结合密度。

2. 吸液针位置过低刮擦孔底

吸液针若设定过低，尤其是在酶结合抗体孵育后清洗步骤，可能刮伤孔底，使部分复合物随液体一起被移除。

3. 剧烈震荡或吸液造成流场不稳

洗板机带震荡功能时，过度涡旋可造成蛋白分子从孔底“翻起”，在随后的吸液步骤中被排出。

4. pH 值或温度变化影响结合稳定性

某些洗液（如含Tween 20的PBST）在长期放置或批次不同情况下，pH偏离标准范围，可能破坏蛋白结构，从而降低结合稳定性。

5. 非封闭表面蛋白流失

在封闭步骤前或封闭不充分时，洗板清洗可能洗去未牢固吸附在微孔板表面的抗原或抗体。

四、哪些情况更容易受洗板影响？

1. 早期实验阶段洗板风险更高

抗原或抗体初次包被后，若封闭剂使用不规范，蛋白未牢固吸附，此时进行洗板，影响最大。

2. 敏感性极高的超低浓度实验

低浓度抗体或抗原试剂在高稀释比例条件下，结合力弱，容易因物理扰动或局部浓度下降脱离固相。

3. 使用劣质或未经处理的微孔板

未做高结合处理的聚苯乙烯微孔板表面对蛋白的吸附能力差，极易在清洗中脱落。

4. 设备设置不当

如泵速过快、喷头偏斜、吸液针未校准、液体注入高度不统一，均可能导致局部扰动强度过大。

五、洗板机洗板对不同类型ELISA的影响差异

1. 直接法ELISA

抗原直接吸附于孔板后与标记抗体结合，此类方法中抗原稳定性对洗板影响较大。若板材或封闭剂选择不当，洗板极易洗掉部分抗原，造成结果偏低。

2. 间接法ELISA

在洗板步骤前后都有多次孵育，抗原抗体复合物形成较牢固，若洗板程序温和，影响相对较小。

3. 夹心法ELISA

抗体包被-抗原结合-检测抗体孵育构成完整链条，对清洗要求极高，稍有不足或过度都可能影响结合效率，背景值、交叉污染和灵敏度都易受影响。

4. 竞争法ELISA

特别依赖量变关系，洗板中的微小扰动（如复合物流失）均可能造成比值误判。

六、实际研究与经验数据支持

多篇研究指出：

• 抗原或抗体在经过适当封闭后，其结合稳定性足以抵抗中低强度洗板操作；

• 合理设置清洗程序不会显著影响结合结构，反而提高信噪比；

• 当洗板次数超过8次、清洗时间长于5分钟、采用高压脉冲注液等极端条件时，部分低亲和复合物可被破坏；

• 高压微喷洗板方式比传统大流量注液对抗体洗脱影响更小，因其采用局部细致洗涤，扰动更温和；

• 有研究建议通过“平衡性测试孔”判断洗板是否造成结合流失，即设置空白与阳性组之间多个不同结合程度的对照组，通过洗后结果偏差来评估清洗强度是否合适。

七、如何在实际中规避洗板对结合的影响？

1. 选用高结合力微孔板

如高亲和力表面（Nunc Maxisorp等），提高抗原或抗体的吸附强度。

2. 优化封闭步骤

使用高质量的封闭剂（如5% BSA、10%脱脂奶粉等），有效覆盖未结合区域，增强结合稳定性。

3. 合理设置洗板参数

• 注液体积不超过孔容的80%；

• 吸液针高度距离孔底0.5–1.0 mm；

• 控制清洗次数在3–5次，避免过度清洗；

• 禁用不必要的高强度震荡。

4. 洗板前后加入温和缓冲液

如PBST（含Tween 20）可减少蛋白非特异吸附并缓冲液体剪切力。

5. 定期校准洗板设备

包括液量均一性、注吸对准度、压力调节器等，确保流体动力学稳定。

八、实验室质量控制建议

• 制定洗板性能评估标准，定期检查残留液体与清洗均匀性；

• 采用评估试剂盒（如TMB染色残留）验证清洗无交叉污染；

• 设计标准化SOP流程，对不同实验类型设置不同洗板程序；

• 为不同试剂批次、孔板类型建立“清洗敏感性数据库”；

• 将洗板参数与实验数据结果建立联动回溯系统，便于问题追踪。

九、结论

回归本文核心问题：“洗板机洗板过程中是否会影响抗原抗体结合？”

科学答案是：在参数设置合理、实验流程标准化、孔板封闭充分、抗原抗体浓度适宜的前提下，现代洗板机的清洗过程不会对抗原抗体结合造成显著负面影响，反而有助于去除非特异性结合，提升实验信噪比和重复性。

但如果设备老化、参数设定不当、孔板质量较差、蛋白结合不牢或封闭不充分，清洗过程确实可能造成抗原抗体复合物部分破坏，影响最终数据准确性。