一、离心分层的基本原理
离心分离是利用旋转体产生的离心力将混合液中的组分依照密度差异分层的过程。当低速离心机以一定转速启动后，样品在转子中受到向外的离心加速度作用，不同密度的颗粒或溶质被加速至不同程度，形成从内向外依次排列的层次结构。密度较大的组分因承受的离心力更强，迁移更快，最终沉积于试管底部；而密度较小的组分在离心力作用下移动较慢，因而停留在上层。该过程归纳为三大阶段：加速阶段——粒子开始移动并产生速度差；平稳阶段——各相沿径向达到近似稳态；减速阶段——转速降低，分层结构得以保持直至停机。

二、相分层机理细节

1. 密度梯度驱动
   混合液中每一种组分都具有特定密度（ρ），在离心场中，单位体积受到的离心力与ρ成正比。根据Svedberg方程，沉降系数s与粒径、形状以及溶剂粘度相关，而ρ差异是决定最终位置的关键因素，密度差越大，分层越明显。

2. 粘度与流体阻力
   溶剂的粘度η会对粒子迁移速率产生阻碍，粘度增大将减缓颗粒的相对运动速度，导致分层边界更为模糊。因此，常见做法是在低温环境（如4 °C）操作，以降低粘度、抑制热扰动。

3. 剪切力与湍流效应
   当转速较高时，混合液内会产生径向剪切和环流，若速度梯度过大可能引起湍流，使部分微粒回流或相互碰撞，影响分层效果。因此，低速离心机通常限制在数千rpm范围，以兼顾分离效率与流场稳定性。

4. 界面张力及毛细现象
   在不同相之间，界面张力γ决定了相分界面的平滑程度。若界面张力较低，两相之间易出现混溶区域；相反，较高的界面张力则有助于形成清晰分界。毛细管作用在微量样品管中尤其显著，需要注意管壁与液体的润湿性。

5. 颗粒形状与尺寸分布
   不同形状的颗粒在离心力场中受到的阻力不同，球状颗粒阻力最小，非球形或片状颗粒则会因横截面差异产生额外阻力，导致分离效果不一。此外，粒径分布越窄，分层越清晰；宽分布则会出现过渡带。

三、影响分层质量的关键参数

1. 转速（rpm）
   离心速度直接影响离心力F＝mω²r，其中ω与rpm成正比。低速离心机一般设置在500–5000 rpm范围内，需根据样品性质和实验目的选取合适转速。较低转速可减少剪切破坏，但分离时间需相应延长；较高转速可加快分层，却易产生剪切损伤。

2. 离心时间
   分层时间t决定了颗粒迁移距离。时间过短会导致分离不完全，残留悬浮颗粒；过长则可能使上清液中出现沉积杂质或样品交叉污染。通常实验室会预设2–15 min不等，并通过预试优化。

3. 温度控制
   温度T影响液体粘度和颗粒Brown运动能量。在较低温度下（如4 °C），分层更稳定，但若温度过低会增大粘度，延长所需时间；常温（20–25 °C）则适用于一般细胞或血浆分离。

4. 转子类型与角度

• 固定角转子（一般为25°–45°）：有利于颗粒直接径向下沉；

• 水平摆转子：试管从垂直状态摆至水平，可形成扁平沉积面；

• 倾斜式转子：兼具固定角与水平摆的优势，形成经典分层。
  不同转子也会改变r值分布，进而影响离心加速度分布。

5. 装载平衡
   重量对称装载保证转子平衡，避免振动导致分层紊乱或仪器损伤。建议使用天平校准管内质量，偏差一般控制在0.01 g以内。

6. 样品浓度与体积
   浓度过高会造成颗粒聚集、相互干扰；浓度过低则层析界面难以察觉。体积过大或超过转子设计容量，会影响流场分布，导致分层失效。

四、分层过程的观测与表征

1. 目测法
   离心结束后静置1 min，借助试管底部可以看到明显的沉淀带、界面和上清液。对于细胞或血液样品，可辨认血球层、血浆层和血清层。

2. 分光光度测定
   上清液可取样后在紫外/可见光谱中测量特征波长吸光度，以评估分层纯度。例如，通过检测260 nm可判断核酸残留，280 nm可估算蛋白质含量。

3. 显微镜观察
   将分层后的颗粒悬浮液取样置于载玻片下，可直接观察颗粒形态及分布情况，进一步评估分离效果。

4. 密度梯度离心
   在含不同浓度蔗糖或OptiPrep（碘化密度梯度媒介）的管中离心，分层更为精细，可获得连续或分段分布的样品，适用于亚细胞结构分离。

五、分层机制的理论模型

1. 斯托克斯定律
   对于低雷诺数范围内的球形微粒，其沉降速度v＝2r²(ρ_p–ρ_m)ω²r/(9η)，体现了粒径r、密度差(ρ_p–ρ_m)和溶剂粘度η的关系，是描述分层速度的基础方程。

2. Svedberg方程
   s＝v/ω²r，用于表征颗粒在特定离心场下的沉降系数s，可用于蛋白质、核酸等生物大分子分离过程中的精确计算。

3. 有限元流场模拟
   通过数值模拟软件（如COMSOL Multiphysics），可以得到旋转体内的流场分布和剪切力场，揭示湍流区域及颗粒沉积轨迹，指导转子设计与参数优化。