台式离心机临床分离细胞治疗产品（如CAR-T细胞）样品制备中离心要求？
一、前言与背景
在细胞治疗产品制备流程中，离心步骤常用于分离外周血单个核细胞（PBMC）、去除血浆或培养基交换、细胞浓缩与洗涤等关键环节。台式离心机因其操作便捷、灵活性高、占地较小，常见于实验室和小规模制备环境。但针对CAR-T等临床级别细胞制备，离心操作须满足严格的质量与安全要求，以确保细胞活性、纯度与安全性符合GMP规范和临床研究或商业生产标准。以下分别就设备特性、运行参数、无菌与生物安全、验证与维护、记录管理等方面详细展开。
二、设备选型与安装条件
台式离心机类型与功能需求
应优先选择设计适用于生物材料处理的型号：具备可控温度（通常4℃～25℃可调）、可编程转速和加减速曲线设置，以及配套密闭转子或安全桶。
根据样本量和离心管规格，确定所需转子类型：常见有固定角度转子和摇臂（摆动）转子。固定角度转子适合较快速分离、短时间高g处理；摇臂转子便于层析分离（如密度梯度），因水平离心有助于形成清晰界面。
考虑设备与实验室环境集成：若需联网以记录运行日志，应预留网络或USB接口；若需置于生物安全柜内，应选配外型尺寸与散热要求兼容的机型，并注意散热风道或加装外部冷却。
对于处理高价值或临床用细胞，应考虑带有温度监控与报警、转速误差检测、超速保护及不平衡保护功能的机种，以减少细胞损伤风险。
安装环境与基础条件
放置位置应符合实验室GMP区域规划：若在无菌或洁净区内使用，需确定离心机产生的气流或震动不会影响洁净度；若需置于生物安全柜中操作，需确认柜体尺寸足够、通风或排气不受影响，同时设备散热和排风方式不干扰柜内气流循环。
电源要求：稳压电源、UPS（不间断电源）支持可降低因电力波动或断电对离心程序的影响；建议为关键离心步骤预留紧急供电或中断应急预案。
温度与湿度：实验室整体环境应保持符合细胞处理需求（一般温控在18℃～25℃），避免环境过热导致离心腔体或样品温度升高。
防振与隔振：台式离心机运行时会产生震动，应放置在稳固、水平的工作台面上，如有必要加装减振垫，以减少对周围仪器和环境的干扰。
三、操作参数与程序设计
转速与相对离心力（RCF）选择
不同制备阶段需要不同离心力：如分离PBMC时常用密度梯度离心，通常设定在约400×g左右；洗涤或浓缩步骤可采用300～500×g范围，根据细胞类型及耐受性调整。若需要沉降更细胞或去除残余碎片，可轻微提高至600×g，但应避免过高g值以减轻剪切应力。
计算RCF需基于转子半径（最大半径或平均半径），推荐在SOP中明确公式RCF = 1.118 × 10^-5 × r × (RPM)^2，并注明所用转子的具体半径数值，以便操作者准确设定。
针对不同体积和管径：大体积（如50 mL锥形管）与小体积离心管，其受力差异和热传导不同，参数设定应在验证阶段进行实验，以确定既能充分分离又不过度损伤细胞的最佳转速和时间组合。
离心时间与分段流程
密度梯度离心：通常设定30～40分钟左右（含加速与减速过程）以获得清晰分层，但不同试剂和样本差异需通过预实验确定最佳时间；在程序中可预设静止时间（无刹车或轻刹车）以避免扰动界面。
洗涤与重悬：使用适合的缓冲液（如PBS或含人体血清白蛋白的缓冲液），设定较短时间（如5～10分钟）以快速沉淀细胞，避免长时间离心导致细胞应激。多次洗涤时，可分步设计：第一遍较宽松参数去除大部分血浆或残留物，后续遍渐次调整，确保细胞纯净与活力。
加速/减速曲线：在密度梯度步骤，需使用轻柔加速与减速（低加速度、无刹车或缓慢刹车）以保护界面结构；在洗涤浓缩时，可使用适中加减速。离心机程序应可预设档位，且在SOP中明确不同步骤所用曲线级别。
温度控制：若样本对温度敏感（例如需维持在4℃以防止代谢或激活），应将离心温度设置至4℃，并监控腔体温度稳定性；过程开始前需预冷离心腔体；若步骤间需快速过渡，确保样品在转移时不受温度剧变影响。
平衡操作：样品管应严格配对平衡放置，若样品数量为奇数，可使用等重平衡管或加入平衡液。平衡误差会导致离心机震动、运行中断或损坏设备，对样品安全和离心机寿命都有影响。
密闭与消耗品选用
离心管材质与适配：应选用GMP级或符合生物处理要求的无毒、低吸附离心管；若含有贵重或罕见细胞，应使用低结合材料或预处理防止细胞黏附管壁。管盖需密封良好，避免泄漏或气溶胶扩散。
使用封闭转子或安全桶：在操作涉及病原体或未经知悉状态的生物样本时，应选配带密封盖的转子或安全桶，减少潜在泄露风险；封闭转子可能对温度控制有额外要求，需在验证时确认温度均匀性。
一次性或可重复使用部件：若采用可重复使用转子或适配器，需建立清洗与高温/化学消毒流程；使用过程中若有损伤或老化迹象，应及时更换并记录。
程序验证与优化
在正式投入临床级细胞制备前，应通过预验证实验：对指定参数组合进行小规模测试，评估细胞回收率、活力、功能指标（如增殖能力、表面标志表达、功能性测定等），并据此优化离心条件。
检测指标可包括总细胞产量、死细胞比例、目标细胞群富集率、细胞功能活性（如CAR表达检测、细胞毒性或分泌因子分析），结合离心参数做响应曲面分析，确保最佳平衡。
验证过程中应记录所有实验数据与操作细节，并进行统计分析，对重复性和可重复性进行评估；如存在较大波动，需查明原因并调整SOP或设备校准。
四、无菌与生物安全管理
无菌操作环境
离心操作应尽量在生物安全柜或洁净区内完成：若样品已在无菌操作台中转移到离心管，需快速封管并移至离心机；若离心机置于安全柜外，管口封闭质量尤为关键。
样本转移与管口封闭：在移液和管口放置过程中，需佩戴无菌手套，使用酒精或其他合适消毒剂对管口进行擦拭；若可能，采用一次性无菌离心管并在离心前用无菌封帽或防漏环加固。
离心机周边消毒：在每次操作前后，对离心腔室、转子、桶盖等进行适当消毒（如用符合生物安全要求的消毒液擦拭），并确保残留消毒剂对细胞无毒害；若使用湿擦消毒，待表面干透再放入样本。
防止交叉污染
样本分类与标识：严格按实验批次标注离心管，避免混淆；不同供体或批次不得在同一转子中混合离心；若必须并行处理多份，应使用严格区分的转子位置并记录。
废弃物处理：离心后废弃液、耗材如离心管、吸头等应按照生物安全废弃物流程处理，不应与普通垃圾混放；对潜在病原体样本，应在高压蒸汽灭菌后再丢弃。
转子与设备清洁：针对不同样本类型（例如血液或细胞培养物），需分级清洁；若处理过病例样本或可能含病原体样品，应专用转子或严格清洗消毒后再用于其他样本。清洗记录需归档，并在SOP中明确清洗剂种类、浓度、时间及冲洗方式，以免残留影响后续实验。
生物安全防护
离心过程中潜在气溶胶：高速离心若样本泄露，可能产生气溶胶传播风险，尤其在处理含病原菌或未知病原体的样本时，必须使用带有密封盖或安全桶，并在预定场所进行离心。
个人防护：操作者需穿戴合规个人防护装备，如实验服、防护眼镜、手套，必要时佩戴面罩或呼吸防护器具；在离心过程中应避免长时间暴露在设备近距离，以防意外泄漏时受影响。
泄漏应急：若发生离心管破裂或样本泄漏，应立即停止设备、待完全停止后在生物安全柜或指定区域进行清理，按照泄漏应急预案进行消毒和废弃物处理，并记录事件、原因及整改措施。
五、设备校准、维护与验证
离心机性能校准
定期校准转速：使用校准仪器或专业服务，通过测量实际离心机转速与设定值偏差，确认误差在可接受范围（如±2%以内）；校准报告应注明校准日期、仪器型号、环境条件、操作者及结果。
温度校验：对于带制冷功能的离心机，应定期验证腔体温度与设定温度一致性；可使用温度探头在不同位置测量，确保均匀度；校准结果记录并评估是否影响细胞活性。
不平衡检测与安全功能测试：定期检查不平衡报警系统、门锁功能、超速保护及刹车系统，确保这些安全装置在故障时能正常工作；测试结果需归档并在SOP中注明测试频次。
验证流程（IQ/OQ/PQ）
安装确认（IQ）：安装位置、供电、环境条件、设备型号与出厂文档比对；检查软件版本、配件是否齐全；记录序列号与出厂校准证书。
操作确认（OQ）：通过预设参数（转速、温度、加减速曲线）运行离心机，监测实际输出是否与预期一致；在不同转速和温度下进行多次运行，记录并分析数据；测试报警与安全机制触发情况。
绩效确认（PQ）：在真实或模拟样本制备条件下使用离心机执行典型工艺步骤，评估细胞回收率、活力及功能结果；结合前述预验证实验，确认设备在实际运行环境中满足制备要求。PQ记录应详细记载样本类型、参数、结果指标及结论，作为设备合格投入使用依据。
日常维护与保养
日常检查：每次使用前后观察转子、适配器是否有裂纹、腐蚀或变形；检查密封圈、盖子锁扣是否完好；如发现异常立即更换或报修。
定期保养：依据厂商建议或实验室SOP，定期进行深度清洁、润滑（若适用）和功能测试；记录保养内容、执行人、日期；若涉及拆卸部件，应有明确操作流程并要求专业人员执行。
软件升级：若离心机控制系统有新版固件或软件，应在升级前评估对运行参数与记录功能的影响，完成升级验证后方可常规使用；升级过程和结果也需记录并存档。
六、质量管理与记录归档
SOP与操作指导文件
针对台式离心机在细胞治疗制备中各步骤编写详细SOP，内容包括设备准备、离心参数选择、样本转移、平衡操作、温度预冷、离心程序启动、结束后处理、清洁消毒流程等；各条款应说明操作要点、注意事项及判断标准。
SOP应定期评审并在版本更新时培训操作者；保留历史版本以便追溯。文档中可对常见偏差情况进行说明及应对指导（如离心不启动、不平衡报警、温度异常等）。
批记录与日志
每次离心操作都应在批记录或日志表中留存：记录操作日期、时间、操作者、设备编号、转子编号、转速、RCF、温度、运行时长、加减速曲线设置、样本标识、平衡管信息、运行结果（如是否顺利完成）、异常情况及处理措施。
对于涉及关键节点（如PBMC分离、最终细胞浓缩、去除残余试剂等）应突出记录，并在批次报告中注明离心关键步骤对下游质量的影响评估。
离心机自带的电子日志（如运行曲线、温度曲线）应导出并归档，与手工记录进行对比核查，确保电子记录与手工记录一致。若出现不一致，应调查原因并在记录中说明。
追溯与审查
建立设备和运行记录的追溯体系：通过唯一编号或条码标识离心机、转子、离心管等，关联到每次操作记录，实现全流程可追溯。
定期质量审核：质量部门或第三方进行审计，抽查离心记录和设备维护档案，检查是否符合SOP和合规要求；对发现问题提出整改建议并跟踪落实。
指标监控：统计离心相关关键指标，如运行异常率、不平衡报警次数、温度偏差事件、离心过程导致细胞损失率等，通过指标分析优化流程或调整维护计划。
数据完整性与安全
记录应满足可归属、可读、及时、原始、准确、完整、一致、持久、可获取原则；电子日志系统应具备审计追踪、防篡改与备份功能。
日志与报告存档需符合GMP要求：纸质文件应按批次装订、签字盖章并加以妥善保存；电子数据应定期备份至安全服务器或云平台，并设置访问权限与加密保护，防止数据丢失或泄露。
在系统迁移或升级时，需制定数据迁移方案，确保历史记录完整转移并可继续检索。
七、人员培训与资质管理
操作人员资格
操作者须具备细胞处理基础知识、离心原理理解以及GMP规范意识；应通过理论培训和实际操作考核后，方可独立执行离心相关工艺。
对新员工或实验室人员，安排针对台式离心机的专项培训，包括设备功能介绍、操作流程、紧急情况处理、生物安全操作等；培训完成后进行实操评估并记录结果。
定期复训：依据实验室内部规定或监管要求，至少每年或出现SOP更新时进行复训；组织模拟故障演练和偏差处理演习，以强化应急处置能力。
培训内容与考核
内容涵盖：离心机基本结构与工作原理、RCF与转速换算、加减速曲线意义、温度控制要点、平衡操作、无菌与生物安全要求、异常报警及故障排查、清洁与维护流程、记录填写规范、设备校准概念等。
考核可分为笔试与实操：理论部分测试离心原理及风险意识，实操部分考察正确设置参数、平衡操作、关闭加速刹车、样品转移与管口封闭、转子安装与拆卸、应对报警处理能力、清洁消毒操作等。考核结果应记录在个人培训档案中。
角色分工与沟通机制
实验室应明确与离心相关职责：如谁负责设备日常检查与清洁，谁负责运行记录审核，谁负责维护联系与校准计划管理，谁负责批次记录汇总和质量审查等。
建立沟通渠道：当发现设备异常、离心效果差、细胞回收问题或安全隐患时，及时向质量部门或设备管理员报告并跟进；定期召开技术交流会，分享经验与教训，持续改进操作流程。
八、风险识别与应急措施
潜在风险点
不平衡导致离心机震动、自动停止或损坏；可能损伤细胞、泄漏样本。
离心管破裂或泄漏，产生生物气溶胶风险。
温度控制失效，导致细胞活性受损或激活。
参数设置错误（转速过高或时间过长），引起细胞机械损伤或沉降效率不足。
电源波动或突断电，离心过程中断，导致样本暴露或影响分层。
清洁不当或消毒残留，对后续样本产生毒性或污染。
操作者不熟悉程序，记录遗漏或错误，影响追溯和合规性。
应急预案
不平衡处理：若报警，应立即停止并检查样本配对和平衡管；在SOP中给出快速判断和纠正步骤，避免长时间震动或多次尝试后仍无法平衡时造成设备损伤。
管破或泄漏：离心过程中如发现异常声响或泄漏，先停止离心机，待完全停转后在生物安全柜或指定区域穿戴防护清理；按泄漏应急流程消毒并记录，检查离心机腔体及转子是否受污染或损坏。
温度异常：监测到温控不在设定范围，应立刻中止运行并将样本置于备用冰盒或冷藏条件；记录事件并通知维修人员尽快检修后再使用。
电力中断：若断电导致离心中途停止，应根据实验阶段决定是否重新设置：若分层尚未形成，应重新开始；若已分层但时间不足，应评估是否继续运行或重新取样；应急SOP中应给出指导。可借助UPS短时间维持设备运行或安全卸载。
清洁与消毒事故：若误用化学品导致对离心管或细胞有害，应停止使用受影响耗材并更换，记录原因并评估对样本的影响；对设备进行正确消毒并确认无残留。
记录丢失或错误：若发现记录不完整，应及时补充说明原因及补救措施，并由质量部门评估对批次质量的影响；加强培训与审核，避免再发。
风险评估与控制措施
在SOP制定阶段或设备引入时，进行风险评估（如FMEA分析），识别关键故障模式及其后果，制定预防和缓解措施；例如针对不平衡风险，要求严格称重平衡及视觉检查环节；针对泄漏风险，要求使用密闭转子并在生物安全柜内操作。
建立关键控制点（CCP）：如每次离心前必须完成平衡校验、温度预冷确认、安全盖锁紧确认；在记录中强制勾选“已完成”项目，若未完成不得继续。
监控与改进：持续跟踪故障或异常事件频次，分析趋势并采取改进措施，例如更换更耐用的离心管、升级离心机报警系统、优化平衡流程或加强人员培训。
九、集成流程与后续衔接
与上游样本采集对接
采集外周血或细胞悬液后，应尽快转运至制备区域并保持适宜温度；离心前需确认样本容器类型、抗凝剂种类、体积等；记录采集时间与运输条件，以便评估样本质量对离心效果的影响。
如涉及多中心采集，需统一运输与接收流程，确保到达后立即或在可接受窗口内进行离心处理；延迟处理需在记录中注明并评估对细胞活性的潜在影响。
与下游细胞处理结合
离心完成后，细胞需进行下一步操作（如磁珠标记、激活、培养基更换、基因转染或病毒感染等），需要将离心结果（回收率、体积变化、细胞密度等）及时传递给下游工艺环节。
在流程设计中，应考虑离心步骤对下游步骤的要求，如细胞浓度、悬浮方式、缓冲液配方等，并在SOP中注明；若需要调整下游参数，应基于离心结果动态优化并记录。
离心后细胞处理要尽量无缝衔接，以避免细胞在中间环节暴露于非理想环境，如过长时间室温暴露或机械挤压。
自动化与信息系统集成
若实验室信息管理系统（LIMS）或生产管理系统支持接口，可将离心机参数和日志自动导入，减少手工输入错误；结合条码或RFID标签，实现样本与离心记录自动关联，提高效率和可追溯性。
对于需要批量生产或更高通量的场景，可考虑半自动化或集中离心平台，但仍需保持台式离心机在小规模评估或紧急备用场景中的灵活使用；在系统集成时，要确保离心机操作数据能够实时上传并存储，以便质量部门快速审查。
十、持续改进与评估
关键指标监测
制定并跟踪与离心相关的质量指标，如细胞回收率、活力保持率、成功分层率、离心故障停机率、设备维护完成率等；通过定期分析，发现潜在问题或改进空间。
对新批次制备项目或新设备引入时进行评估：比较不同离心机或参数配置对细胞质量的影响，选择最佳实践并更新SOP。
技术升级与新方法引入
随着技术发展，可关注更温和或更高效的分离方法（如旋转膜分离、微流体分选等），评估其对传统离心流程的替代或补充作用；在引入新技术时，需同样进行验证、培训与记录管理。
对现有离心机功能进行迭代：如增加内置温度追踪、实时监控仪表、远程控制或报警集成，以提升过程可视化和安全性；所有改动均需评估对细胞质量及数据完整性的影响并在验证中确认。
经验反馈与知识共享
建立跨团队或跨项目的经验库，记录在不同批次制备中遇到的离心相关问题及解决方案，如某类型离心管易碎、某温度设定下细胞存活下降等；通过定期分享和讨论，避免重复错误。
鼓励操作者和质量人员提出改进建议，并对可行方案进行小规模试验；对成功优化的流程及时纳入SOP，以促进组织内部持续升级。
十一、总结
台式离心机在CAR-T及其他细胞治疗样品制备链条中虽属常见设备，但其操作细节和质量管理对最终产品安全性与有效性影响重大。需从以下方面全面把控：
设备与环境条件：选择合适型号、确认安装和散热条件，在GMP区或生物安全柜兼容使用；
参数与流程设计：合理设定转速、RCF、时间、温度及加减速曲线，并通过预验证实验优化；
无菌与生物安全：采用密闭转子、合规耗材，在无菌环境或生物安全柜中操作，防止交叉污染与气溶胶风险；
校准与验证：严格执行IQ/OQ/PQ及日常校准、性能确认，确保离心机运行可靠；
质量记录与追溯：完善SOP、批记录、电子日志导出和纸质归档，满足可归属、可读、及时、原始、准确、完整、一致、持久、可获取的要求；
培训与职责分工：确保存储在岗人员掌握离心原理、风险预防与应急处理，明确各环节责任；
风险管理与应急预案：识别不平衡、泄漏、温度异常、电力中断等风险，制定并演练对应措施；
集成与持续改进：与上游样本采集和下游处理无缝对接，通过信息系统和自动化提升效率与可追溯性，不断监测关键指标并优化流程。
