一、引言

紫外分光光度计（UV-Vis Spectrophotometer）是一种广泛应用于化学、生物、环境、食品、药品等领域的分析仪器，基于朗伯-比尔定律对物质吸收紫外和可见光的特性进行定量或定性分析。

在日常检测过程中，操作者有时会遇到“吸光度异常偏高”的情况，表现为：测得的吸光度值远高于理论值，或空白样品就显示出高吸光度，甚至出现“超量程”（如A > 3.999）等报警现象。这类问题不仅会导致结果失真，影响数据可信性，还可能是仪器、样品、操作或环境因素异常的信号。

要有效应对这一问题，必须全面分析其成因，结合具体现象逐一排查，从而找出根源、修正数据、保证实验质量。

二、吸光度的定义与正常范围理解

1. 吸光度（Absorbance, A）定义

根据朗伯-比尔定律：

A=log⁡10(I0I)=ε⋅b⋅cA = \log_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right) = ε·b·cA=log10(II0)=ε⋅b⋅c

其中：

• $A$：吸光度；

• I0I_0I0：入射光强；

• $I$：透射光强；

• $\epsilon$：摩尔吸光系数；

• $b$：比色池光程长度（cm）；

• $c$：溶液浓度（mol/L）。

2. 正常吸光度范围

通常情况下，UV-Vis检测的最佳吸光度范围为 0.1–1.0，最大不得超过 2.0–3.0（视仪器而定）。当吸光度超过3.5，几乎无光透过，数据已不再可靠。

三、吸光度异常偏高的常见原因分类

吸光度偏高可能由下列五大类因素造成：

1. 样品问题

2. 比色皿污染或损坏

3. 仪器硬件故障

4. 操作与使用不当

5. 环境干扰因素

下面逐项深入解析。

四、样品相关因素分析

1. 样品浓度过高

• 原理：高浓度溶液会吸收绝大多数入射光，透射光极弱，导致吸光度偏高或超限；

• 排查方法：按比例稀释样品（如10倍、100倍）后重新测试，若吸光度下降则说明浓度过高；

• 建议：对未知样品先进行梯度稀释试验，找到线性检测区间。

2. 悬浮物或气泡存在

• 原理：非溶解颗粒或微气泡会散射光线，模拟“吸收”现象；

• 表现：重复测量波动大，且吸光度始终偏高；

• 解决：样品过滤或离心除杂，操作时避免剧烈振荡。

3. 样品中有高背景吸收物质

• 如杂质、试剂副产物、染料、金属络合物等；

• 建议：同步测定样品空白（仅溶剂和试剂）以扣除背景。

4. 样品分解或沉淀

• 放置过久或光照引起变质，产生沉淀或颜色加深；

• 应用新鲜制备样品，避免样品暴露于强光、高温环境。

五、比色皿和样品池问题

1. 比色皿污染

• 指纹、残留溶液、油渍、水垢等；

• 排查方法：更换新比色皿或清洗后重复测试；

• 清洗建议：使用去离子水、无水乙醇或专用清洗液处理。

2. 比色皿光程不一致或方向插反

• 部分比色皿存在方向性（特别是矩形皿），插反可能使光程变短或透光面被遮挡；

• 建议在比色皿上标记光路方向，确保一致性。

3. 比色皿或样品池损伤

• 如划痕、裂纹、老化发黄；

• 这些瑕疵会产生杂散光或额外吸收；

• 更换新比色皿是最有效方式。

六、仪器硬件相关原因

1. 光源老化或强度异常

• 氘灯或钨灯输出不稳定、老化导致能量分布不均；

• 表现：短波区域（如200–300 nm）吸光度突然升高；

• 解决方案：检查灯使用时间，更换新灯并校准。

2. 光路未对准或光窗脏污

• 光束未正中比色池，或光窗上有尘埃、油污；

• 观察方法：目视检查光窗、使用空白液体测试；

• 处理：清洁光窗、调整样品架。

3. 检测器饱和或异常

• 光电二极管或PDA阵列出现过载；

• 信号电压异常高或完全饱和；

• 表现为吸光度跳变或极限值（如3.999）；

• 需由技术人员检修或更换检测器模块。

4. 基线校准错误

• 基线未置零或校准失败；

• 空白测量后未重新校准；

• 处理：重新执行空白校正，避免旧校准覆盖新实验。

七、操作不当引发的误差

1. 光源未预热

• 氘灯、钨灯未达到稳定状态即测量；

• 导致光强波动，吸光度结果不稳定或偏高；

• 建议：开机后预热15–20分钟再开始测试。

2. 光程选择错误

• 使用短光程比色皿但系统仍按1cm光程计算；

• 建议确保样品架参数设置与实际匹配。

3. 比色皿液面过满或过少

• 过满可能引起溢出污染光窗；

• 过少会让光线通过气体层；

• 建议液面高度保持在比色皿刻度线附近。

4. 波长设置不当

• 若选择了错误的吸收峰波长，可能误测干扰峰；

• 使用标准吸收波长如 254 nm、280 nm 等可提高准确性。

八、环境与干扰因素

1. 杂散光影响

• 来自光学系统缝隙、比色皿间隙或外部光源；

• 表现为低波长区吸光度偏高；

• 检查：关闭实验室强光源，使用遮光罩，密封样品池盖板。

2. 温度波动

• 样品、仪器、环境温差过大引起吸光度变化；

• 某些化合物吸收强度对温度敏感；

• 建议恒温控制或室温平衡后操作。

3. 电磁干扰

• 仪器附近有强电设备运作（如离心机、电炉）；

• 可导致检测器输出噪声上升；

• 建议：避免紫外分光光度计与强磁设备同桌摆放。

九、排查流程建议

遇到吸光度异常偏高时，建议按如下顺序进行排查：

1. 是否为真实高浓度样品？
→ 稀释样品验证是否可恢复正常范围；

2. 比色皿或样品池是否污染？
→ 更换清洁比色皿，空白测试确认；

3. 仪器光源、光窗是否正常？
→ 检查灯状态与光路清洁度；

4. 软件设置是否正确？
→ 校准波长、重新置零、确认光程设置；

5. 外部干扰是否可控？
→ 检查环境光、温度、电磁波等影响。

若以上都无法排查出原因，则可能为仪器老化、检测器损坏、系统配置异常，应联系技术人员处理。

十、建立吸光度异常记录与响应机制

实验室可通过以下方式建立标准响应流程：

• 设置“异常数据登记表”记录每次偏差；

• 规范稀释与清洗操作流程；

• 建立“光源使用时长记录表”，避免超期使用；

• 实行每月仪器性能检测，包括基线稳定性、光强输出、线性响应；

• 对吸光度 >3.0 的样品强制二次稀释再确认；

• 每季度组织技术培训，提高操作者判断与操作能力。

十一、结语

紫外分光光度计吸光度异常偏高问题，并非单一现象所致，而往往是样品处理、设备维护、操作行为和环境条件综合作用的结果。通过对影响因素的深入理解与系统排查，实验室人员不仅可以快速识别问题，还能逐步建立一套自我纠错与预防的技术机制。

保障紫外分光光度计数据的准确性与可重复性，必须从“科学使用、规范操作、及时保养”的角度出发，将每一处细节落实到位。只有如此，分析工作才能稳健、可信、高效。