如何用UV法测定DNA浓度？
1. 引言
DNA提取与纯化是现代分子生物学实验体系的起点，而准确评估提取产物中的DNA浓度与纯度是后续实验设计与数据可靠性的前提。紫外分光光度法作为无损定量分析技术，已成为绝大多数实验室日常检测DNA浓度的首选方法之一。与荧光染料法、电泳半定量法相比，UV法以操作便捷、成本低、检测快速而受到广泛青睐。尽管原理简单，但影响DNA紫外测定准确性的因素复杂，需系统性掌握其技术内涵。
2. 紫外分光光度法的原理基础
2.1 DNA的紫外吸收特性
DNA分子中嘌呤（A、G）、嘧啶（C、T）碱基含有大量共轭双键体系，形成稳定π-π*跃迁吸收：
最大吸收波长 λmax ≈ 260 nm；
主要贡献来自碱基芳香环；
脱氧核糖与磷酸骨架对吸光影响极小。
2.2 朗伯-比尔定律在DNA定量中的应用
DNA溶液的吸光度A在260 nm波长下与其浓度成正比：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸光系数（与核酸类型有关）；
c：浓度；
l：光程（一般为1 cm）。
3. UV法测定DNA浓度的操作流程
3.1 样品准备
样品溶液应透明、无明显混浊；
若DNA浓度过高，可稀释至吸光度介于0.1~1.0 A之间；
常用缓冲液：TE缓冲液、无RNA酶水、10 mM Tris-HCl (pH 7.5~8.0)。
3.2 仪器准备
紫外分光光度计波长设置：260 nm；
使用石英比色皿（普通玻璃吸收UV）；
比色皿内壁无划痕、无气泡。
3.3 测定步骤
以纯缓冲液为空白进行调零；
将待测DNA溶液置入比色皿；
读取A260吸光度值；
同时记录A280、A230吸光度用于纯度评估；
记录数据并进行浓度计算。
4. DNA浓度计算方法
4.1 吸光度与浓度换算系数
按照国际通用标准：
dsDNA（双链DNA）：
CdsDNA(μg/mL)=A260×50C_{dsDNA} (\mu g/mL) = A_{260} \times 50CdsDNA(μg/mL)=A260×50
1 A260 对应浓度为 50 μg/mL；
计算公式：
ssDNA（单链DNA）：
CssDNA(μg/mL)=A260×33C_{ssDNA} (\mu g/mL) = A_{260} \times 33CssDNA(μg/mL)=A260×33
1 A260 对应浓度为 33 μg/mL；
计算公式：
RNA：
1 A260 对应 40 μg/mL；
用于区分RNA污染成分。
4.2 实例计算
某DNA溶液A260 = 0.85：
若为双链DNA，则：
浓度=0.85×50=42.5μg/mL浓度 = 0.85 \times 50 = 42.5 \mu g/mL浓度=0.85×50=42.5μg/mL
4.3 稀释倍数换算
若样品稀释10倍后测得A260：
原液浓度 = 42.5 μg/mL × 10 = 425 μg/mL。
5. DNA纯度评估——A260/A280比值
5.1 蛋白污染检测
蛋白质最大吸收波长 λmax ≈ 280 nm（主要来自酪氨酸、色氨酸）；
以A260/A280比值评价纯度；
理想值为 1.8~2.0（双链DNA最佳区间）；
比值低于 1.8，提示蛋白或酚类污染；
比值高于 2.0，可能存在RNA或小分子有机物干扰。
5.2 A230吸收干扰
A230反映盐、酚、碳水化合物污染；
A260/A230理想值为 2.0~2.2；
低于此值可能提示有机物残留。
6. UV法DNA定量的优势与适用范围
6.1 优势
样品无需染料标记；
无损检测，样品可重复使用；
操作简单、快速（约5分钟内完成）；
适用于高浓度DNA初筛、质控监测。
6.2 适用范围
纯化DNA浓度初步估算；
PCR、克隆、测序前模板浓度标准化；
病毒载体、质粒制备工艺控制；
实验室日常常规核酸样品浓度检测。
7. UV法DNA定量的局限性与误差来源
7.1 灵敏度局限
检出限较高（一般 >2 μg/mL）；
低浓度DNA测定误差显著上升；
不适合痕量样本分析。
7.2 纯度干扰
蛋白质、酚、RNA残留影响吸光度；
多组分重叠吸收导致误判。
7.3 溶剂背景吸收
水、缓冲盐浓度、pH值影响背景吸光度；
比色皿污染、指纹污渍产生光散射偏差。
7.4 dsDNA与ssDNA误差
UV法无法区分单双链DNA；
适用吸收系数不同导致误差；
某些退火、解链样品需明确链型状态。
7.5 氧化产物吸收
存储不当DNA氧化断裂后吸收曲线变化；
增加A230背景吸收。
8. UV法与荧光染料法对比
| 指标 | 紫外分光光度法 | 荧光染料法 |
|---|---|---|
| 灵敏度 | μg/mL | ng/mL级甚至pg/mL |
| 专一性 | 低 | 高（结合DNA专一位点） |
| 操作复杂度 | 简单 | 需染料与标准曲线 |
| 适用浓度区间 | 高中浓度 | 极低浓度 |
| 成本 | 低 | 染料成本高 |
| 样品消耗 | 无损 | 染料消耗样品一部分 |
结论：UV法适用于纯化后DNA初步浓度评估；荧光法适合痕量DNA精准定量。
9. 紫外分光光度计性能要求与仪器选择
9.1 波长精度
精度 ≤ ±1 nm；
保证260 nm测定波长准确性。
9.2 吸光度线性范围
推荐 0.1~1.5 A 区间；
吸光度过高时需稀释检测。
9.3 比色皿选择
石英比色皿（190~1100 nm）；
光程1 cm（标准）；
微量检测可选用微量比色皿（如NanoDrop平台）。
9.4 微量DNA检测平台
微量样本体积 1~2 μL；
无需标准比色皿；
避免样品稀释误差；
适合痕量核酸定量。
10. UV法DNA定量中的常见问题与解决策略
| 问题表现 | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| A260/A280 比值低 | 蛋白、酚污染 | 重复酚/氯仿提取、乙醇沉淀净化 |
| A260/A230 比值低 | 盐、碳水残留 | 重新乙醇沉淀、柱纯化 |
| 吸光度异常高 | 比色皿污渍 | 彻底清洗比色皿 |
| 低浓度波动大 | 信号接近仪器检出限 | 样品浓缩或换用荧光法 |
| A260 > 2.0 | 可能RNA污染 | 酶消化去RNA后复测 |
11. UV法DNA定量的发展趋势
11.1 自动化微量平台集成
微量样本输入；
自动背景校正；
批量连续分析；
数据自动输出。
11.2 AI算法辅助纠偏
自动识别谱图异常；
误差自学习模型；
提高复杂样品纯度评估准确性。
11.3 多波长修正算法
多波段联合拟合；
更精准校正杂质吸收；
适用于复杂生物样品分析。
11.4 智能便携式设备
现场即时核酸定量；
云平台远程监控；
集成到分子诊断设备模块中。
12. 结语
紫外分光光度法因其无损、快速、便捷等优势，已成为DNA浓度测定中应用最广泛的标准方法之一。虽然在灵敏度与特异性上存在一定局限，但在日常核酸提取、质控检测、常规浓度评估等场景中依然具备不可替代的应用价值。随着检测技术平台化、智能化与数据驱动分析的发展，UV法DNA定量将在实验室自动化管理体系中扮演更为重要的技术支撑角色。
