紫外分光光度计可用于蛋白质测定吗？
1. 引言
蛋白质的浓度测定是生命科学研究、医药生产与生物技术开发中必不可少的常规实验操作。准确的蛋白浓度数据对于后续的酶学研究、免疫分析、结构研究与临床检测均有直接影响。目前，蛋白质定量方法种类丰富，其中紫外分光光度法凭借其快速、简便、无需复杂试剂等优势，在蛋白质定量体系中占据着重要位置。
与染料比色法（如Bradford、BCA法）、荧光法相比，紫外法（UV法）在许多实验场景中依然是首选基础技术。因此，深入理解紫外分光光度计在蛋白质测定中的适用性、原理与技术细节，对提升实验操作质量具有重要意义。
2. 紫外分光光度法的基本原理
2.1 朗伯-比尔定律基础
紫外法定量分析基于朗伯-比尔定律：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸光系数；
c：溶液浓度；
l：光程长度。
紫外吸收强度与样品浓度成正比，通过测量吸光度实现浓度定量。
2.2 蛋白质分子中的吸收来源
蛋白质紫外吸收主要来源于其氨基酸残基：
芳香族氨基酸：
色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）；
肽键吸收：
n→π* 跃迁形成强吸收；
硫醇类基团与辅基（少数蛋白特有吸收）；
多肽链整体吸收。
3. 蛋白质紫外吸收的关键波长
3.1 280 nm吸收峰（芳香族残基吸收）
色氨酸与酪氨酸在280 nm处具有强吸收；
绝大多数天然蛋白质在此波长具有特征吸收峰；
常作为常规蛋白浓度测定主波长。
3.2 205 nm吸收峰（肽键吸收）
肽键主链羰基在远紫外区有较强吸收；
所有蛋白质均有强烈205 nm吸收峰；
灵敏度较高，但溶剂与杂质干扰严重。
3.3 其他相关波长
| 波长 | 吸收来源 | 说明 |
|---|---|---|
| 220 nm | 肽键次级吸收 | 常用于补充参考 |
| 230 nm | 溶剂残留吸收 | 常作为污染监控 |
| 260 nm | 核酸吸收 | 区分蛋白核酸污染 |
| 320-350 nm | 浊度背景吸收 | 悬浮杂质监控 |
4. 蛋白质UV法定量的两大技术路径
4.1 直接紫外吸收法（A280法）
原理
测量蛋白溶液在280 nm波长下的吸光度；
吸收强度直接与蛋白浓度相关；
基于蛋白本身内源性吸收，无需外加试剂。
公式
C(mg/mL)=A280ε×MWC (\text{mg/mL}) = \frac{A_{280}}{\varepsilon} \times MWC(mg/mL)=εA280×MW
ε：蛋白分子吸收系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）；
MW：蛋白分子量。
优势
快速；
无需耗材；
可用于蛋白纯度监控。
局限
依赖蛋白结构特异性；
色氨酸/酪氨酸含量影响结果；
复杂混合物适用性差。
4.2 远紫外法（A205法）
原理
测量肽键吸收强度；
几乎所有蛋白质在205 nm处有强烈吸收；
不依赖于特定氨基酸组成。
公式
C(mg/mL)=A20531C (\text{mg/mL}) = \frac{A_{205}}{31}C(mg/mL)=31A205
（经验系数 31 mg/mL·A）
优势
与蛋白种类无关；
灵敏度高；
适合低浓度蛋白检测。
局限
对缓冲液干扰极其敏感；
需要高纯石英比色皿；
空白背景漂移显著。
5. UV法蛋白定量的应用场景
5.1 蛋白提取初筛
纯化蛋白总量估算；
监控提取效率；
粗定量后进行进一步纯化。
5.2 重组蛋白表达检测
蛋白表达体系中产物浓度估算；
细胞裂解液直接快速检测。
5.3 蛋白质纯度监控
配合 SDS-PAGE 电泳确认；
监控纯化后核酸污染水平（A260/A280比值）。
5.4 药物制剂蛋白含量检测
单抗浓度测定；
疫苗蛋白载量定量；
生物制剂生产质控环节。
5.5 临床检测与酶学研究
血清总蛋白快速测定；
酶活单位计算中底物浓度换算。
6. UV法蛋白浓度测定的操作流程
6.1 样品准备
样品澄清透明；
若需稀释，选用紫外吸收低缓冲液（如PBS、Tris）；
注意去除沉淀、气泡。
6.2 仪器设置
紫外分光光度计调至280 nm；
比色皿为石英材质（190~1100 nm透光）；
光程一般取 1 cm。
6.3 检测步骤
以空白缓冲液调零；
测定样品A280吸光度；
计算浓度（如有ε值则代入计算）。
7. UV法蛋白定量中的常见修正算法
7.1 核酸污染修正
蛋白提取中常混入RNA/DNA污染，可用A260/A280比值评估：
理想蛋白比值 ≈ 0.55；
比值升高提示核酸污染；
部分实验采用以下修正公式：
A280,corrected=A280−(A260×0.57)A_{280, corrected} = A_{280} - (A_{260} \times 0.57)A280,corrected=A280−(A260×0.57)
7.2 混合蛋白修正
对于复杂混合蛋白溶液（如血清蛋白）：
可使用标准品绘制标准曲线；
代入A280读数换算总蛋白含量；
参考值：人血清总蛋白 1 A280 ≈ 1.0 mg/mL。
8. UV法蛋白定量的优势与局限性分析
8.1 优势总结
| 优势 | 说明 |
|---|---|
| 快速 | 5分钟内完成 |
| 无需染料 | 试剂成本低 |
| 非破坏性 | 样品可保存 |
| 易标准化 | 重复性好 |
| 仪器普及广 | 实验室标配仪器均可使用 |
8.2 局限总结
| 局限 | 说明 |
|---|---|
| 灵敏度受限 | 检出限 >0.1 mg/mL |
| 蛋白结构依赖 | ε值需准确 |
| 缓冲液吸收干扰 | 205 nm特别敏感 |
| 纯度要求高 | 核酸、酚、色素易干扰 |
| 蛋白混合物难定量 | 无法区分不同蛋白亚型 |
9. UV法与比色法蛋白测定对比
| 项目 | 紫外法 | Bradford法 | BCA法 |
|---|---|---|---|
| 灵敏度 | 中 | 高 | 高 |
| 线性范围 | 窄 | 宽 | 宽 |
| 操作简便性 | 极高 | 中 | 中 |
| 受缓冲液影响 | 大 | 小 | 小 |
| 适合样品 | 纯蛋白 | 粗样品 | 蛋白混合液 |
| 检出限 | >0.05 mg/mL | <1 μg/mL | <5 μg/mL |
结论：UV法适合高纯蛋白快速定量，其他比色法适合低浓度与复杂样品。
10. UV法蛋白定量的技术优化与趋势
10.1 微量化检测平台
纳米光程比色池（0.05~0.5 mm）；
样品用量降至 1~2 μL；
微量蛋白样品适用性大幅提升。
10.2 多波长修正算法
结合A205与A280联合拟合；
背景污染自动扣除；
提高复杂体系定量准确度。
10.3 智能比色校正系统
比色皿自洁自动监测；
纠正比色皿污染导致漂移误差；
适合自动高通量检测系统。
10.4 联合色谱光谱检测平台
在线HPLC-UV联用；
实现蛋白纯化与定量同步监测；
提高生物制剂质量控制效率。
10.5 AI驱动算法建模
建立蛋白种类-吸收系数大数据库；
输入序列预测ε值；
实现个性化蛋白快速精确定量模型。
11. 紫外分光光度计选型建议（针对蛋白定量）
12. 结语
紫外分光光度计作为生命科学实验室的核心基础设备，在蛋白质浓度测定中依然发挥着重要作用。尽管UV法在低浓度、复杂体系中存在一定局限，但其在纯化蛋白、日常监控与实验预处理环节仍是效率极高的技术工具。未来，借助微量平台、多波长建模与智能算法优化，紫外法蛋白定量将在高通量、精准化与智能化方向持续演进，成为实验室整体自动化流程中不可或缺的重要环节。
