如何用UV法测定DNA浓度？
1. 引言
DNA的提取与纯化是各类分子生物学实验的前提，准确测定DNA浓度对于下游实验（如PCR扩增、测序、克隆、转染、芯片杂交等）设计和结果的可靠性至关重要。UV分光光度法因其简洁、高效，成为最常用的DNA浓度测定技术之一，尤其适合于实验室日常样品初步定量和质控检测。
2. 紫外分光光度法测定DNA浓度的基本原理
2.1 DNA的紫外吸收特性
DNA分子中的碱基部分富含共轭双键，尤其是嘌呤（A、G）和嘧啶（C、T）环，能在紫外区产生强烈的π→π*跃迁吸收：
DNA最大吸收波长：260 nm；
脱氧核糖和磷酸骨架本身不产生紫外吸收。
2.2 朗伯-比尔定律
UV法基于朗伯-比尔定律：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸光系数；
c：待测物浓度；
l：比色池光程（通常为1 cm）。
在特定条件下，DNA浓度与其在260 nm处的吸光度成线性正比关系。
2.3 DNA类型与吸收系数
| 样品类型 | ε 值 (A260对应浓度) |
|---|---|
| 双链DNA（dsDNA） | 1 A260 = 50 μg/mL |
| 单链DNA（ssDNA） | 1 A260 = 33 μg/mL |
| RNA | 1 A260 = 40 μg/mL |
不同核酸类型需选用对应的换算系数。
3. UV法测定DNA浓度的操作流程
3.1 仪器准备
紫外分光光度计；
石英比色皿（普通玻璃比色皿不透过紫外光）；
波长设置为260 nm（必要时同时检测230 nm、280 nm用于纯度评估）。
3.2 样品准备
DNA样品须澄清透明、无沉淀；
样品浓度需稀释至吸光度A260约0.1~1.0范围内；
稀释用液需与空白匹配（如TE缓冲液、无RNA酶水等）。
3.3 测定步骤
用空白溶液调零；
加入DNA样品，读取A260值；
同时记录A280及A230用于纯度分析；
记录并计算浓度。
3.4 浓度计算示例
假设A260读数为0.75：
对于双链DNA：
浓度=A260×50μg/mL=0.75×50=37.5μg/mL浓度 = A260 \times 50 \mu g/mL = 0.75 \times 50 = 37.5 \mu g/mL浓度=A260×50μg/mL=0.75×50=37.5μg/mL
若样品稀释10倍测定，则原液浓度为375 μg/mL。
4. DNA纯度评估指标
4.1 A260/A280比值
理想值为1.8~2.0；
低于1.8可能存在蛋白或酚类污染；
高于2.0可能存在RNA污染。
4.2 A260/A230比值
理想值为2.0~2.2；
低值提示盐、酚、碳水化合物等杂质干扰。
A260/A280与A260/A230比值是UV法DNA测定中的重要质控指标。
5. UV法DNA浓度测定的优势
| 优势 | 技术说明 |
|---|---|
| 快速高效 | 几分钟即可获得数据 |
| 无损耗 | 样品可回收重复使用 |
| 设备普及 | 大多数实验室均配备 |
| 操作简便 | 无需复杂试剂和化学反应 |
| 经济环保 | 耗材成本低，试剂用量少 |
UV法特别适用于DNA纯化过程监控、大量样品批量检测以及PCR前的模板浓度调整。
6. UV法DNA测定的局限性
| 局限性 | 技术表现 | 解决对策 |
|---|---|---|
| 灵敏度有限 | 检出限高于2 μg/mL | 微量样品采用荧光法 |
| 纯度干扰 | 共存蛋白、RNA、盐类吸收叠加 | 增加纯化步骤，合理比值控制 |
| 不能区分单双链 | ssDNA吸光系数不同 | 明确核酸类型，选用正确系数 |
| 吸收饱和 | 高浓度吸光度超出线性区 | 适当稀释样品 |
| 溶剂干扰 | pH和盐浓度影响吸光 | 使用统一缓冲液做空白 |
7. UV法测定DNA浓度常见误差来源
7.1 比色皿污染
水渍、指纹、划痕均会产生光散射误差；
清洗干净并正确握持比色皿非常重要。
7.2 样品气泡
微气泡导致测定不稳定；
需轻轻甩动样品消除气泡。
7.3 比色皿位置偏移
放置不平稳会影响光路一致性；
每次检测保证比色皿固定对中。
7.4 稀释误差
移液器使用准确性直接影响稀释浓度；
建议使用校准良好的微量移液器。
8. UV法与荧光法在DNA定量中的对比
| 指标 | UV法 | 荧光法 |
|---|---|---|
| 灵敏度 | μg/mL 级 | ng/mL 级甚至pg/mL |
| 选择性 | 低 | 高（可区分DNA、RNA） |
| 操作简便性 | 非常高 | 略复杂 |
| 试剂依赖性 | 无 | 需荧光染料 |
| 多样本适用性 | 大量样本适合 | 痕量样本适合 |
| 成本投入 | 低 | 略高 |
UV法适用于大部分日常纯化样品浓度评估，而荧光法更适合极低浓度或极高纯度要求的样品。
9. UV法测定DNA浓度的典型应用场景
| 应用环节 | 主要目的 |
|---|---|
| DNA提取后检测 | 评估提取效率 |
| 质粒制备监控 | 确保浓度与纯度达标 |
| PCR模板稀释 | 精确配置扩增体系 |
| 测序送样 | 保证上机前质量控制 |
| 克隆转化前检测 | 调整转染浓度 |
| 病毒载体生产 | 工艺放大纯化质量监控 |
UV法已成为分子生物学实验室日常运行中的常规标准技术。
10. 紫外分光光度计性能要求
11. UV法DNA定量的未来技术趋势
11.1 微量检测平台
纳米光程池（如NanoDrop）；
仅需0.5–2 μL样品；
避免稀释误差；
微量核酸样品分析主流化。
11.2 智能算法建模
AI辅助比值判断；
自动识别蛋白污染、盐类污染；
实时质量预警系统。
11.3 UV-荧光融合平台
一体化集成UV与荧光检测；
同时输出总量与有效量；
适合高通量自动化平台应用。
11.4 在线过程监控
大规模DNA生产线实时质量监测；
支持核酸药物、基因治疗产业化流程管理。
12. UV法DNA定量标准操作规程简要（SOP）
仪器开机预热20分钟；
检查并清洁石英比色皿；
配制适当浓度样品（吸光度控制在0.1~1.0之间）；
以空白液调零；
测定A260、A280与A230；
按照对应公式计算浓度及纯度比值；
记录数据并出具检测报告。
13. 结语
紫外分光光度法在DNA浓度检测中仍保持着其无可替代的基础性地位。作为一种快速、经济、无损、高效的分析手段，UV法被广泛应用于各类分子生物学实验流程的起始步骤、生产放行环节以及核酸工艺质控体系之中。未来，结合智能算法、微量技术、自动控制与多模式联用，紫外法DNA定量技术将在分子生物学、基因治疗、疫苗研发等新兴生物技术产业中持续焕发新的活力。
