如何用UV法测定DNA浓度？
1. 引言
DNA是生物遗传信息的载体，分子生物学、医学诊断、基因治疗、疫苗研发等多个领域均离不开核酸操作。DNA的提取、纯化后需进行定量分析，确保下游实验的核酸模板充足且质量合格。多种核酸定量技术中，紫外分光光度法因其无损、快速、高通量特点，在科研与生产实验室长期被广泛使用。
2. UV法测定DNA浓度的原理基础
2.1 DNA的紫外吸收特性
DNA分子中的碱基（腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C）含有共轭双键体系，吸收紫外光，主要是 π→π* 跃迁：
DNA吸收最大值出现在260 nm；
脱氧核糖和磷酸骨架不参与紫外吸收；
纯DNA在230 nm和280 nm也有较弱吸收，常用于纯度监控。
2.2 朗伯-比尔定律应用
吸光度（A）与DNA浓度（c）呈正比：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸收系数；
c：DNA浓度；
l：光程（通常1 cm）。
2.3 不同核酸类型吸收系数
| 样品类型 | 换算系数 |
|---|---|
| 双链DNA（dsDNA） | 1 A260 = 50 μg/mL |
| 单链DNA（ssDNA） | 1 A260 = 33 μg/mL |
| RNA | 1 A260 = 40 μg/mL |
3. UV法测定DNA浓度的标准步骤
3.1 仪器准备
3.2 样品准备
DNA溶液应澄清透明；
样品浓度稀释至A260读数在0.1–1.0范围；
稀释溶剂应与空白对照一致（如TE缓冲液、无RNA酶水）。
3.3 操作流程
仪器预热稳定；
用空白溶液校零；
测量样品A260值；
同时测A280与A230用于纯度评估；
记录数据进行计算。
3.4 浓度计算公式示例
如A260=0.75，检测双链DNA：
DNA浓度=0.75×50=37.5μg/mLDNA浓度 = 0.75 \times 50 = 37.5 \mu g/mLDNA浓度=0.75×50=37.5μg/mL
若稀释10倍测定，则原样浓度为375 μg/mL。
4. UV法测定DNA纯度的重要指标
4.1 A260/A280比值
纯DNA：1.8–2.0；
低于1.8提示蛋白或酚污染；
高于2.0可能为RNA污染。
4.2 A260/A230比值
理想值：2.0–2.2；
低值提示盐类、碳水化合物、酚等杂质干扰。
A260/A280 和 A260/A230 是核酸定量常用的质量控制双指标。
5. UV法测定DNA浓度的适用场景
| 应用场景 | 技术价值 |
|---|---|
| DNA提取效率评估 | 快速监测提取得率 |
| 质粒纯化浓度控制 | 确保克隆转染模板合格 |
| PCR前模板定量 | 精准配置扩增体系 |
| 测序送样质量控制 | 确保样品符合上机标准 |
| 基因组文库制备 | 保证建库前核酸浓度充足 |
| 生物制药质控 | 工艺放大核酸药物浓度监控 |
6. UV法测定DNA浓度的优势总结
7. UV法测定DNA浓度的局限性
| 局限性 | 影响表现 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 灵敏度有限 | μg/mL级别以下精度不足 | 荧光法适合痕量检测 |
| 选择性不足 | RNA、蛋白等共吸收 | A260/A280、A230比值监控纯度 |
| 稀释误差 | 操作不规范引入偏差 | 使用高精度移液器 |
| 比色皿污染 | 指纹、水渍干扰吸光度 | 定期清洗、校验比色皿 |
| 溶剂背景干扰 | 缓冲液吸收产生虚高 | 采用严格配对空白校正 |
8. UV法测定DNA浓度的误差来源与排查
| 误差来源 | 典型表现 | 排查思路 |
|---|---|---|
| 比色皿不洁 | A值漂移 | 空白稳定性检查 |
| 样品气泡 | 吸光度跳变 | 去泡或重测 |
| 稀释比例错误 | 浓度换算失误 | 标准曲线验证 |
| 光程误差 | 线性漂移 | 比色皿一致性检查 |
| 仪器校准问题 | λmax漂移 | 定期波长校准维护 |
9. UV法与荧光法核酸定量的对比
| 比较项目 | UV法 | 荧光法 |
|---|---|---|
| 灵敏度 | μg/mL | ng/mL甚至pg/mL |
| 专一性 | 低（总核酸） | 高（特异识别DNA/RNA） |
| 操作复杂度 | 低 | 略高 |
| 试剂依赖性 | 无需染料 | 需染料（如PicoGreen） |
| 成本投入 | 低 | 略高 |
| 适用范围 | 批量样品快速检测 | 痕量样品精确定量 |
10. UV法测定DNA浓度的标准曲线应用
在高精度检测需求下，可制作DNA标准溶液系列；
测定各标准吸光度；
绘制标准曲线用于样品浓度换算；
提高测定线性准确性，修正系统误差。
11. UV法在DNA浓度在线监控系统中的应用前景
11.1 生物制药在线监控
核酸疫苗、大分子药物生产线；
实现在线浓度实时反馈调控系统；
支撑连续制造技术发展。
11.2 基因组测序产业链质控
样品制备自动化设备集成UV模块；
实时监测文库构建及上机样本合格性。
11.3 核酸药物新工艺质控
siRNA、mRNA工艺研发；
UV监控合成产率与纯化效率。
12. UV法测定DNA浓度未来技术创新方向
12.1 微量UV检测平台
微光程系统（如NanoDrop）；
样品消耗量降至0.5–2 μL；
减少稀释误差，提升高浓度样本适应性。
12.2 AI算法智能定量系统
深度学习模型训练浓度换算；
融入质量控制预警系统；
实现动态干扰识别与自动修正。
12.3 UV-荧光复合检测模块
一体化定量模块同时输出总量与有效量；
支持高通量文库构建自动质控平台。
12.4 在线实时监控技术
适配生产型连续流反应器；
实现动态浓度实时采集与智能反馈控制。
13. UV法测定DNA浓度的国际标准规范
| 标准编号 | 适用范围 |
|---|---|
| ISO 22174:2005 | 核酸提取与纯化后UV法定量通则 |
| USP <851> | 紫外法设备校验与应用规范 |
| CLSI EP06 | 分析方法线性范围验证 |
| 药典通则 | DNA浓度测定紫外法广泛应用于PCR模板制备 |
14. 结语
紫外分光光度法在DNA浓度测定中因其快速、经济、无损、通用性强而被广泛应用于科研实验室、基因组学平台、生物制药质控与临床核酸检测体系。尽管其灵敏度与特异性存在一定局限，但通过优化操作、加强纯度监控、结合标准曲线与算法修正，UV法仍是当前DNA定量体系中最具普适性的常规标准技术之一。未来，随着智能算法、多模式融合、自动在线控制技术发展，紫外法将持续拓展其在核酸定量中的应用深度与产业价值。
