紫外分光光度计可用于蛋白质测定吗？
1. 引言
蛋白质浓度的准确测定是诸多生命科学实验的重要前提，例如：
蛋白纯化收率评估；
酶活性计算；
抗体药物浓度监控；
食品蛋白质质量控制；
临床血清学检测。
目前蛋白质浓度测定技术包括：
紫外吸收法（UV法）
比色法（Bradford法、BCA法、Lowry法）
荧光法
质谱法
其中紫外分光光度法因其普适性和便捷性，已成为蛋白浓度日常测定的重要工具。
2. 紫外分光光度法测定蛋白质的原理
2.1 蛋白质的紫外吸收特性
蛋白质溶液在紫外区有强烈吸收，主要源于以下基团的电子跃迁：
| 吸收来源 | 吸收波长 | 跃迁类型 |
|---|---|---|
| 色氨酸（Trp） | 280 nm | π → π* |
| 酪氨酸（Tyr） | 280 nm | π → π* |
| 苯丙氨酸（Phe） | 257 nm | π → π* |
| 肽键（C=O-NH） | 205 nm | n → π* |
2.2 测定公式
依据朗伯-比尔定律：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸收系数；
c：蛋白质浓度；
l：比色皿光程（通常为1 cm）。
3. UV法蛋白测定的两种主要波长
3.1 280 nm（A280法）
依赖芳香族氨基酸含量；
适合高纯度蛋白；
不适合肽、小分子蛋白或芳香族含量少的样品。
3.2 205 nm（A205法）
依赖肽键吸收；
适用于几乎所有蛋白；
对缓冲液成分敏感，需严格控制溶剂背景。
4. 紫外法蛋白质测定的适用范围
| 样品类型 | 推荐波长 | 适用性说明 |
|---|---|---|
| 重组蛋白 | 280 nm | 需知ε值 |
| 抗体类蛋白 | 280 nm | 广泛应用于单抗浓度测定 |
| 多肽、短链蛋白 | 205 nm | 适合芳香族残基少者 |
| 混合蛋白提取液 | 205 nm或比色法 | 紫外需谨慎使用 |
5. UV法蛋白测定的详细操作步骤
5.1 样品制备
澄清透明无沉淀；
浓度稀释至A值0.2–1.0；
样品与空白使用相同缓冲体系。
5.2 仪器设置
开启紫外分光光度计；
预热至稳定；
使用石英比色皿。
5.3 测定步骤
以空白液调零；
测定样品吸光度（A260、A280、A205）；
计算浓度。
5.4 浓度换算公式示例（以A280为例）
蛋白质浓度（mg/mL）=A280ε×分子量蛋白质浓度（mg/mL） = \frac{A_{280}}{\varepsilon} \times 分子量蛋白质浓度（mg/mL）=εA280×分子量
如采用经验值估算：
1 A280 ≈ 1.0 mg/mL（部分标准蛋白近似值）。
6. UV法蛋白质测定的应用场景
| 应用领域 | 测定目的 |
|---|---|
| 生物医药 | 抗体制剂浓度监控 |
| 分子生物学 | 蛋白提取量评估 |
| 酶工程 | 单位活性换算依据 |
| 蛋白质纯化 | 动态监控纯化效率 |
| 食品工业 | 蛋白质营养强化剂含量检测 |
| 临床检验 | 血清总蛋白监测 |
7. UV法蛋白质测定的优势分析
| 优势 | 技术表现 |
|---|---|
| 快速便捷 | 3-5分钟完成测定 |
| 成本低廉 | 无需额外试剂消耗 |
| 重复性好 | 吸光度稳定易控 |
| 无需标准品 | 可直接计算浓度 |
| 适合自动化 | 易整合入自动定量系统 |
8. UV法蛋白质测定的技术局限
| 局限性 | 技术表现 | 解决措施 |
|---|---|---|
| 依赖ε值准确性 | ε不确定导致误差 | 建议测定或查阅可靠文献数据 |
| 核酸污染干扰 | A260重叠吸收 | 通过A260/A280比值校正 |
| 缓冲液吸收背景 | 背景虚高A值 | 使用匹配缓冲液作空白扣除 |
| 浑浊样品散射 | 吸光度异常偏高 | 过滤澄清样品 |
| 蛋白多态性影响 | 蛋白变性影响吸收特性 | 控制样品保存条件与缓冲体系 |
9. 蛋白纯度评估中的UV指标
9.1 A260/A280比值
纯蛋白标准值：0.55；
高于0.6：核酸污染可能性高；
低于0.5：色素或其他杂质干扰可能性高。
9.2 双波长修正法
应用修正公式：
A280(corrected)=A280−(A260×0.57)A_{280(corrected)} = A_{280} - (A_{260} \times 0.57)A280(corrected)=A280−(A260×0.57)
有效减弱核酸污染影响，提升蛋白浓度准确性。
10. UV法蛋白测定与比色法的对比
| 项目 | UV法 | 比色法（如Bradford法） |
|---|---|---|
| 灵敏度 | μg/mL级 | ng/mL级 |
| 适用范围 | 高纯蛋白 | 混合样本 |
| 试剂依赖 | 无需 | 需专用试剂 |
| 受缓冲液干扰 | 较强 | 相对较弱 |
| 自动化能力 | 高 | 中等 |
| 操作复杂性 | 低 | 略高 |
| 适合样本量 | 大 | 微量更优势 |
11. UV法蛋白测定的标准曲线法应用
用标准蛋白（如BSA）配制系列浓度；
测定A280，绘制标准曲线；
适合复杂样本或ε不明蛋白；
便于跨批次、跨样本一致性控制。
12. UV法蛋白质测定在新型技术中的融合
12.1 微量UV定量平台
如NanoDrop；
样品体积仅需0.5–2 μL；
节约高价值蛋白样本资源。
12.2 在线实时监控系统
UV模块嵌入纯化柱后；
实现蛋白峰流动态采集；
支持连续纯化工艺智能化控制。
12.3 UV-质谱联用分析
UV预浓度监控；
质谱进行序列鉴定与完整性确认；
实现质量与数量双重评价。
12.4 AI智能定量算法
训练蛋白序列与ε值模型；
实现无需手动查表的实时浓度换算；
提高新型蛋白快速定量能力。
13. UV法蛋白质测定未来发展趋势
14. UV法蛋白浓度检测国际标准参考
| 标准编号 | 适用范围 |
|---|---|
| USP <851> | 紫外分光光度法通则 |
| ICH Q2 | 方法学验证通用标准 |
| EP 2.2.25 | 欧洲药典紫外法规定 |
| CLSI EP06 | 分析方法线性验证 |
15. 结语
紫外分光光度计不仅可用于常规有机分析，在蛋白质浓度测定中同样展现出强大的技术实用价值。它作为实验室蛋白质定量的第一道门槛，不仅高效快捷，且在高纯蛋白分析、工艺质控、科研平台自动化中占据重要技术支撑地位。未来，随着AI算法、多模式分析平台与自动化在线监控技术的持续升级，紫外法将在蛋白质分析应用中持续拓宽应用边界，为生命科学与生物制药产业智能升级提供有力技术支撑。
