紫外分光光度计可用于蛋白质测定吗？
一、引言
在分子生物学实验和生物制药生产中，蛋白质含量的准确测量是实验成功的基础。不同实验所需蛋白浓度差别巨大，如：
蛋白纯化收率统计；
酶活性单位计算；
抗体药物定量；
生物大分子药物质控；
食品蛋白营养分析；
医学检测中血浆蛋白含量监控等。
在诸多蛋白测定方法中，紫外分光光度法因其简单、快速、无需额外染料、样品消耗少，成为实验室中普及度最高的一种蛋白定量手段。
二、紫外分光光度法检测蛋白质的基本原理
2.1 蛋白质的紫外吸收特性
蛋白质溶液在紫外光区具有明显吸收，吸收来自其氨基酸残基中的发色团与肽键的贡献：
| 吸收来源 | 主要基团 | 吸收波长 |
|---|---|---|
| 芳香族吸收 | 色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe） | 257–280 nm |
| 肽键吸收 | 羰基（C=O）、胺基（-NH-） | 190–210 nm |
2.2 朗伯-比尔定律应用
蛋白质浓度与吸光度遵循朗伯-比尔定律：
A=ε⋅c⋅lA = \varepsilon \cdot c \cdot lA=ε⋅c⋅l
其中：
A：吸光度；
ε：摩尔吸收系数（L/mol·cm）；
c：蛋白质浓度；
l：光程长度（一般为1 cm）。
通过测定特定波长下的吸光度，可推算出蛋白质的浓度。
三、紫外分光光度计测定蛋白质的常用波长
3.1 280 nm吸收法（A280法）
主要依赖色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸残基的吸收；
适用于中高纯度蛋白样品；
吸收强度与蛋白质类型密切相关。
3.2 205 nm吸收法（A205法）
依赖于肽键的吸收；
适用于几乎所有蛋白质；
对溶液中缓冲盐、添加剂更为敏感。
3.3 其他波长
257 nm：部分芳香族含量丰富蛋白；
230 nm：硫酸盐、核酸、盐类干扰指标；
260 nm：可用于判断核酸污染。
四、不同类型蛋白质的吸收差异
蛋白质种类繁多，不同来源与结构的蛋白其紫外吸收能力存在显著差异：
| 蛋白类型 | A280吸收强度 | A205吸收强度 | 适用方法 |
|---|---|---|---|
| 抗体类（IgG、IgM） | 高 | 高 | A280法常用 |
| 酶类蛋白 | 中高 | 高 | A280与A205均可 |
| 低芳香族蛋白 | 低 | 高 | A205更合适 |
| 多肽、小分子蛋白 | 极低 | 高 | A205适配性强 |
| 粗蛋白提取物 | 不稳定 | 不稳定 | 建议用比色法或荧光法 |
五、紫外分光光度计测定蛋白质的操作流程
5.1 样品准备
样品应澄清透明，避免浊度干扰；
稀释至A值在0.1–1.0范围内；
使用相同缓冲液配对空白对照。
5.2 仪器准备
开启紫外分光光度计预热；
使用洁净石英比色皿；
设定目标波长（205或280 nm）。
5.3 测量步骤
空白调零；
测量样品A值；
代入公式或标准曲线计算蛋白浓度。
5.4 浓度计算实例
以A280测定抗体蛋白为例：
若测得 A280 = 0.75，设 ε = 1.4 mL/mg·cm（IgG常用），则：
蛋白质浓度=A280ε=0.751.4≈0.54 mg/mL蛋白质浓度 = \frac{A_{280}}{\varepsilon} = \frac{0.75}{1.4} \approx 0.54 \, \text{mg/mL}蛋白质浓度=εA280=1.40.75≈0.54mg/mL
六、UV法蛋白纯度评价指标
6.1 A260/A280比值
纯蛋白标准值通常在0.55；
大于0.6说明存在核酸污染；
小于0.5可能含有色素或杂质。
6.2 A230/A280比值
反映盐类或有机溶剂残留；
理想值 2.2–2.5；
低值提示残留污染需进一步纯化。
七、紫外法蛋白质测定的优势与特点
| 技术优势 | 说明 |
|---|---|
| 快速高效 | 5分钟内可完成定量 |
| 样品消耗低 | 微量样本（几微升）即可完成测定 |
| 无需染料 | 不依赖额外显色剂或染料反应 |
| 易于自动化 | 易整合至蛋白纯化监控系统 |
| 适用性广 | 适配绝大部分高纯度蛋白样本 |
八、紫外法蛋白质测定的技术局限性
| 局限性 | 问题表现 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 灵敏度有限 | 微量检测不足 | 采用荧光法或比色法提升灵敏度 |
| 核酸污染 | A260区吸收增加 | A260/A280比值控制纯度 |
| 缓冲液干扰 | 尤其在205 nm明显 | 统一空白缓冲体系 |
| ε值依赖性 | 各蛋白吸收系数不同 | 预先获取目标蛋白ε值或采用标准曲线法 |
| 光散射干扰 | 浑浊样品吸光值偏高 | 样品过滤澄清处理 |
九、UV法蛋白质测定与其他常见方法的对比
| 方法 | 紫外法 | Bradford法 | BCA法 | 荧光法 |
|---|---|---|---|---|
| 灵敏度 | μg/mL | 0.5 μg/mL | 0.5 μg/mL | 0.05 μg/mL |
| 线性范围 | 宽 | 宽 | 宽 | 窄 |
| 染料依赖 | 无 | 需CBB染料 | 需BCA试剂 | 需染料 |
| 缓冲液兼容性 | 差 | 好 | 中等 | 中等 |
| 自动化适配性 | 极高 | 中等 | 中等 | 较高 |
| 适用样本 | 高纯蛋白 | 蛋白混合物 | 蛋白混合物 | 微量蛋白 |
十、UV法蛋白定量在各行业中的应用案例
10.1 生物制药领域
抗体药物浓度在线检测；
工艺放大纯化过程实时监控；
批次一致性自动质控系统集成。
10.2 食品工业领域
乳制品蛋白强化剂含量确认；
植物蛋白饮料中蛋白总量检测；
蛋白粉、胶原蛋白制品质量控制。
10.3 分子生物学研究
蛋白表达与纯化产量评估；
酶活性单位计算浓度校正；
SDS-PAGE上样浓度精准配置。
10.4 医学与临床诊断
血清总蛋白快速测定；
蛋白质缺失综合征监控；
核酸检测前总蛋白背景监测。
十一、紫外法在现代蛋白分析技术中的融合发展
11.1 微量紫外检测技术
纳米光程平台（如NanoDrop、Take3平台）；
样品体积减少至0.5–2 μL；
适合高价值稀有样本检测。
11.2 在线纯化监控系统
紫外模块嵌入纯化柱出口；
实现蛋白流实时浓度反馈；
支持大规模连续纯化工艺智能化生产。
11.3 UV-色谱联用技术
HPLC-UV广泛应用于复杂蛋白纯度检测；
同时兼具分离、定量、纯度三重评价。
11.4 AI算法定量模型
建立蛋白序列-ε值数据库；
实现自动浓度换算与误差修正；
提高新型蛋白快速定量能力。
十二、未来技术发展趋势
| 技术方向 | 发展亮点 |
|---|---|
| 标准化数据模型 | 建立统一吸收系数数据平台 |
| 多波长修正算法 | 提高复杂蛋白混合物定量能力 |
| 紫外-荧光复合检测 | 整合强灵敏度检测与自动修正 |
| 智能质控平台 | 融入生物制药全流程智能工厂 |
十三、结语
紫外分光光度计不仅可以测定蛋白质含量，而且已成为现代实验室日常蛋白浓度检测中不可或缺的标准方法之一。尤其在高纯蛋白、高通量定量、实时质控以及自动化生产中，其速度快、成本低、操作简便的优势尤为突出。未来，随着紫外法不断与AI、大数据、多模式分析平台深度融合，紫外分光光度计将在智能生物制造、分子诊断与个性化医疗领域持续发挥更加核心的作用。
