如何用UV法测定DNA浓度？
速度快 — 上机 1 min 内即可读数；
样品省 — 微量型比色槽 0.5–2 µL 即可；
无标曲 — 大多数情况下可直接用经验换算系数推浓度；
无损耗 — 测完的核酸可回收做下游实验。
因此，虽然荧光染料（PicoGreen、Qubit）灵敏度更高，紫外法仍是“日常快检”和“过程监控”的首选手段。
1 测 DNA 浓度为什么首选 UV？
速度快 — 上机 1 min 内即可读数；
样品省 — 微量型比色槽 0.5–2 µL 即可；
无标曲 — 大多数情况下可直接用经验换算系数推浓度；
无损耗 — 测完的核酸可回收做下游实验。
因此，虽然荧光染料（PicoGreen、Qubit）灵敏度更高，紫外法仍是“日常快检”和“过程监控”的首选手段。
2 DNA 的紫外吸收基础
| 残基 | 主吸收带 | 机理 | 贡献度 |
|---|---|---|---|
| A、G | 260 nm | π→π* | 强 |
| C、T | 257 nm | π→π* | 中 |
| 脱氧核糖 | 无 | — | 忽略 |
经验换算系数
双链 DNA：1 A_260 = 50 µg·mL⁻¹
单链 DNA：1 A_260 = 33 µg·mL⁻¹
RNA：1 A_260 = 40 µg·mL⁻¹
朗伯–比耳定律 A=εclA=\varepsilon c lA=εcl 在 0.1–1.0 A 范围内几乎线性，因此实际测定常把样品稀释到 A_260≈0.2–0.8 之间。
3 仪器与耗材配置清单
| 类别 | 建议规格 | 说明 |
|---|---|---|
| 紫外分光光度计 | 波长准确度 ≤ 0.5 nm | 常规或微量型均可 |
| 比色池 | 石英材质，光程 1 cm；微量型 0.2–1 mm | 石英对 190–300 nm 透光率最高 |
| 空白溶液 | TE、纯水或 Tris 低盐缓冲液 | 空白与样品基体保持一致 |
| 微量移液器 | 0.5–10 µL、10–100 µL | 保证稀释准确 |
4 标准操作流程（SOP）
4.1 预检查
光源预热 ≥ 15 min；
空白槽装入匹配溶液，扫描 230–320 nm，确认基线平直；
波长校验：用 0.02 % K₂Cr₂O₇ 标液，核对 257、313 nm 两点。
4.2 样品处理与稀释
| 原始样品浓度 | 预估 A_260 | 建议稀释倍数 |
|---|---|---|
| ≤ 100 ng·µL⁻¹ | < 0.2 | 直接测 |
| 100–500 ng·µL⁻¹ | 0.2–1.0 | 5–10× |
| ≥ 500 ng·µL⁻¹ | > 1.0 | ≥ 20× |
稀释用缓冲液 pH 7.5–8.5，可减少碱基电离对吸收峰的微移。
4.3 读数步骤
将空白溶液注入比色池 → 调零；
取稀释后样品 1 mL（或 2 µL 于微量槽）上机；
记录 A_260、A_280、A_230 三个吸光度；
反算原液浓度：
CdsDNA(μg⋅mL−1)=A260d×50×DC_{\text{dsDNA}}(\mu g·mL^{-1}) =\frac{A_{260}}{d}\times50\times DCdsDNA(μg⋅mL−1)=dA260×50×D
ddd：光程 (cm)；微量槽常为 0.05–0.2 cm
DDD：稀释倍数。
5 纯度指标双保险
| 比值 | 理想范围 | 含义 |
|---|---|---|
| A_260/A_280 | 1.8–2.0 | 蛋白质或酚污染 ↑→比值↓ |
| A_260/A_230 | 2.0–2.2 | 卡波合物、盐或胍残留 ↑→比值↓ |
若比值异常，可用如下方式修正：
蛋白污染：酚/氯仿抽提或蛋白酶 K 消化；
盐类残留：75 % 乙醇洗涤并重溶；
胍盐：硅胶柱洗脱增加 TE 缓冲体积。
6 微量光程平台要点
| 型号 | 光程 (mm) | 样品体积 | 校准方式 |
|---|---|---|---|
| NanoDrop One | 0.05 / 0.2 | 1–2 µL | 自动折返镜光程 |
| DeNovix DS-11 | 0.03–0.5 | 0.5–2 µL | 传感器检测液柱 |
不必稀释至 0.1–1 A；仪器可自动压缩/延长光程使 A_260 落在量程内；
擦拭方式：测完用无尘纸 + 70 % 乙醇轻拭上下窗口，防止交叉污染；
避免气泡：上下移液枪轻打，保持液滴完整铺展。
7 方法学验证实例
| 项目 | 结果 | 评价标准 |
|---|---|---|
| 线性 | 10–500 ng·µL⁻¹, R² = 0.9998 | 合格 |
| 检出限 | 2 ng·µL⁻¹ (S/N=3) | 满足常规分子实验 |
| 重复性 | 50 ng·µL⁻¹ 六次测定 RSD=1.2 % | ≤ 2 % |
| 准确度 | 标样 100 ng·µL⁻¹，测值 98.7 ± 1.5 ng·µL⁻¹ | 95–105 % |
8 常见“坑点”与快速排查
| 现象 | 可能原因 | 应对 |
|---|---|---|
| A_260 读数跳变 | 光斑有气泡 | 换枪头再次上样 |
| 比值>2.1 | RNA 混入 | 加 RNase A 消化重新测 |
| 比值<1.6 | 蛋白 or 酚 | 再做酚/氯仿抽提 |
| 底噪高 | 比色池脏或光源老化 | 清洗石英面，校验 K₂Cr₂O₇ |
9 拓展应用
qPCR 模板标准化：将 OD 定量与 Ct 值对照，建立曲线，确保每孔模板量一致。
文库定量：高通量测序建库前快速评估双链 DNA 产量，结合片段分析可预判上机读长。
生物制药：mRNA 疫苗工艺开发中，用 UV 法在线监控转录产率与 DNase 消化效率。
核酸药物质控：ASO/siRNA 车间连续生产，可借流动注射+UV 实现闭环实时浓度调节。
10 结语
通用性：UV 法对纯化核酸样品适用面极广；
局限性：对低浓度或重污染样本灵敏度不足，可辅以荧光染料；
趋势：微流控芯片、在线探针与 AI 异常识别算法将把传统“台式 UV”升级为“智能工艺传感器”，让核酸浓度监控更即时、更自动、更可靠。
