紫外分光光度计

紫外分光光度计可用于蛋白质测定吗？

为什么在蛋白质世界里仍需一台 UV-Vis？
实验频率 — 蛋白表达、纯化、配方、冻干、质量放行几乎每天都要“刷”浓度。

时间成本 — 比色法（BCA、Bradford）虽灵敏，但需试剂孵育；UV 直接读数 <3 min。

样本珍贵 — 高纯重组抗体动辄上千美元/毫克；UV-Vis 微量平台只用 0.5–2 µL。

无染料残留 — 后续酶动力学、晶体学试验最怕外来干扰，UV 法测完可把样品“完璧归赵”。

一句话总结：UV-Vis 是蛋白质实验室的“温度计”——不一定最精密，却最方便、最常用、最先上手。

产品详细

1　缘起：为什么在蛋白质世界里仍需一台 UV-Vis？

实验频率 — 蛋白表达、纯化、配方、冻干、质量放行几乎每天都要“刷”浓度。
时间成本 — 比色法（BCA、Bradford）虽灵敏，但需试剂孵育；UV 直接读数 <3 min。
样本珍贵 — 高纯重组抗体动辄上千美元/毫克；UV-Vis 微量平台只用 0.5–2 µL。
无染料残留 — 后续酶动力学、晶体学试验最怕外来干扰，UV 法测完可把样品“完璧归赵”。

一句话总结：UV-Vis 是蛋白质实验室的“温度计”——不一定最精密，却最方便、最常用、最先上手。

2　蛋白质到底靠什么吸收紫外光？

发色团	λ_max / nm	跃迁类型	对吸收强度贡献
色氨酸 (Trp)	278–282	π→π*	★★★★
酪氨酸 (Tyr)	274–276	π→π*	★★★
苯丙氨酸 (Phe)	257	π→π*	★
肽键 C=O	190–205	n→π*	★★★

280 nm 峰：主要由 Trp/Tyr 主导，摩尔吸收系数 ε 常在 5 000–60 000 M⁻¹ cm⁻¹ 之间，取决于残基数目。
205 nm 峰：肽键普遍吸收，可用于缺乏芳香族的肽／蛋白，但要求溶剂杂质极低，石英比色池必不可少。

啰嗦一句：只有含发色团才吸收——胶原蛋白（Trp 极少）在 280 nm 几乎“隐身”；溶菌酶（Trp6 Tyr3）则峰值又尖又高。

3　二条“黄金换算系数”

280 nm：
$C(mg\cdotpmL−1)=A280ε1 %280C(\text{mg·mL}^{-1}) = \frac{A_{280}}{\varepsilon_{1\;\%}^{280}}$

ε_{1 %}^{280}（即 1 mg·mL⁻¹ 时 1 cm 光程的吸光度）可由胺基酸序列计算或文献查表。

205 nm（Scopes 1974 经验式）：
$C(mg\cdotpmL−1)=A20531C(\text{mg·mL}^{-1}) = \frac{A_{205}}{31}$
适用于未知序列、低芳香族蛋白，误差通常 ±10 %。

小贴士：如果不知道 ε_{1 %}^{280}，可用“Brewster 公式”：
$nCys/2\varepsilon_{1\;\%}^{280} = 5500\,n_{\text{Trp}} + 1490\,n_{\text{Tyr}} + 125\,n_{\text{Cys/2}}$

4　五种常见测量模式

模式	适用浓度	样品体积	典型设备
标准 1 cm 石英槽	0.05–2 mg mL⁻¹	1.0 mL	普通 UV-Vis
微量长光程 (1 mm)	0.5–10 mg mL⁻¹	50 µL	半微量比色皿
纳升级可变光程	0.05–250 mg mL⁻¹	0.5–2 µL	NanoDrop、DS-11
原位光纤探头	0.1–100 mg mL⁻¹	在线流体	生物反应控制
205 nm 超短光程 (0.05 mm)	0.02–1 mg mL⁻¹	2–5 µL	超微量比色片

5　标准操作流程（新手友好版）

5.1 预检

开机预热 10–15 min；
检查波长校准（使用 K₂Cr₂O₇：257、313 nm 吸光度比应符合标准）；
比色槽用 2 % Hellmanex 清洗 → 纯水冲洗 → 70 % 乙醇擦干；
空白缓冲液（与样品相同）调零。

5.2 稀释与上样

预计 A_280 最好落在 0.1–1.0（普通槽）或 0.02–0.8（微量设备）之间；
记下最终稀释倍数 D，不要忘在浓度公式中乘回去；
微量平台避免气泡：垂直轻触测量窗，液滴自然铺展开。

5.3 读数与计算

选择测量波长（280 nm 或 205 nm），或扫描 230–360 nm；
同时记录 A_260 / A_230 以评估核酸、盐类污染；
按第二节公式换算实测浓度；
A_260/A_280 ≈ 0.55 为纯蛋白，>0.7 提示核酸混入，可用 DNase/RNase 处理。

6　质量控制与方法学验证

指标	目标值	评价方式
线性	R² ≥ 0.999	配 6 点 BSA 标液
精密度	RSD ≤ 2 %	任一点重复 6 次
准确度	95–105 %	加标回收（BSA 外加）
专属性	ΔA(blank) < 0.01	空白 & 缓冲成分扫描
检出限	≤ 0.02 mg mL⁻¹	S/N=3 法

7　常见问题与“回血”技巧

现象	症结	紧急处理
读数漂移	光源老化	更换氘灯；短期可用内标校正
A_260/A_280 > 1	RNA 污染	加 RNase A 37 °C 15 min
A_260/A_230 < 1	盐 or 胍	乙醇沉淀或超滤脱盐
基线杂波	比色窗污染	重洗石英面，确保无指纹
高浓度吸光饱和	A > 2	稀释 10× 重测或缩短光程

8　三种进阶玩法

8.1 双波长校正法

利用 280 nm（蛋白）与 260 nm（核酸）差异，设方程组同时求出蛋白与核酸浓度，公式如下：

${A280=εp280Cp+εn280CnA260=εp260Cp+εn260Cn\begin{cases} A_{280} = \varepsilon_{p}^{280} C_p + \varepsilon_{n}^{280} C_n \\ A_{260} = \varepsilon_{p}^{260} C_p + \varepsilon_{n}^{260} C_n \end{cases}$

可在蛋白纯化柱流监测阶段实时判断 RNA 去除效果。

8.2 动态混合实验（Stopped-Flow UV）

将酶与底物瞬间混合，0.1 s 内记录 280 nm 吸收变化，可推算芳香族环境暴露度，反映构象变化速率。

8.3 在线 UV 探针 + PID 控制

在抗体发酵罐出口安装 280 nm 光纤探头，实时给 DCS 系统反馈；配合给料泵 PID 调整，可把细胞外蛋白产率波动压缩至 ±5 %。

9　与比色法（Bradford/BCA）的“取舍模型”

维度	UV 直读	Bradford	BCA
准备时间	1–2 min	20 min	30 min
染料依赖	无	Coomassie	BCA/Cu²⁺
溶液兼容	对盐/去垢剂敏感	对表面活性剂敏感	对还原剂敏感
动态范围	0.02–200 mg mL⁻¹（微量可变光程）	1–2 000 µg mL⁻¹	20–2 000 µg mL⁻¹
DNA 干扰	明显	基本无	基本无
在线监控	易	难	难

结论：UV 直读=“快但挑剔”；比色法=“慢但包容”。实验室常以 UV 快速估算→色谱/比色法复核作为双保险。

10　未来展望

光谱-AI 反演：训练序列-ε 值大模型，输入 FASTA 即回吐精准 ε_280，误差＜2 %。
微流控 + 集成光波导：芯片尺寸 < 1 cm²，现场耳机插口供电即可测，望成为便携 QC 标配。
多模态联用：UV-Vis-CD（圆二色）一体机，量浓度同时判二级结构。
绿色实验室：无需染料/重金属试剂，符合 ISO 14001 对实验室可持续发展要求。

结语

能测？能！ 几乎所有含蛋白质的实验流程都在使用 UV-Vis——从 E. coli 小表达管到 10 000 L 抗体发酵罐。
测得准？靠方法。 把握合适波长、光程与纯度校正，重复误差可控在 1–2 %。
会过时？不会。 当微流控、边缘计算和 AI 模型持续加持时，紫外分光光度计将一如既往地做“蛋白世界的体温计”，肩负即时、廉价而可靠的浓度读数使命。

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