一、为什么选用紫外法？

无论在基因克隆、测序建库，还是核酸药物生产线上，实验人员几乎每天都要“扫一眼”核酸浓度。与荧光染料法（PicoGreen、Qubit 等）相比，紫外吸收法具备四大优势：

二、核酸的紫外吸收原理

1. π→π* 电子跃迁：嘌呤（A、G）和嘧啶（C、T）环系在 260 nm 处吸收最强。

2. ε 值经验系数：

• 双链 DNA：1 A₍₂₆₀₎ 对应 50 µg·mL⁻¹

• 单链 DNA：1 A₍₂₆₀₎ 对应 33 µg·mL⁻¹

• RNA：1 A₍₂₆₀₎ 对应 40 µg·mL⁻¹

3. 吸收遵循朗伯–比耳定律

   $$A=\epsilon cl$$

   在 0.1–1 AU 区间近似线性。

三、设备与耗材配置

四、经典操作步骤

4.1 开机与波长校验

• 预热光源 ≥ 15 min；

• 0.02 % K₂Cr₂O₇ 溶液检测 257 和 313 nm 处的 A 比例，若偏差 ≤ ±0.3 %，仪器合格。

4.2 样品前处理

4.3 测量流程

1. 用空白液调零；

2. 加样——普通比色槽 1 mL 或微光程 2 µL；

3. 记录 A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₃₀ 三值；

4. 反推浓度

   C(µg\cdotpmL−1)=A260l×50×DC(\text{µg·mL}^{-1})=\frac{A_{260}}{l}\times 50\times DC(µg\cdotpmL−1)=lA260×50×D

   其中 D 为稀释倍数。

5. 质量判读

• A₂₆₀/A₂₈₀ 应介于 1.8–2.0（蛋白污染↑→比值↓）。

• A₂₆₀/A₂₃₀ 应 ≥ 2.0（盐、酚、胍残留↑→比值↓）。

五、数据质量控制

六、纯度与杂质辨析

1. 蛋白污染

• 特征：A₂₆₀/A₂₈₀ < 1.6

• 解决：蛋白酶 K 消化或酚/氯仿再抽提。

2. 有机溶剂残留（酚）

• 特征：A₂₆₀/A₂₃₀ < 1.8

• 解决：乙醚重洗或硅胶柱净化。

3. 盐分过高

• 特征：A₂₆₀/A₂₃₀ 略低 1.8–1.9，且曲线 220–240 nm 抬升

• 解决：75 % 乙醇洗涤或超滤脱盐。

七、微量测定的特别要点

避免气泡、充分铺展 是微量平台最关键的两件事。测完立即用无尘纸 + 70 % 乙醇擦拭窗口，防交叉污染。

八、方法学验证示例（双链 DNA）

九、常见疑难与解决策略

十、紫外定量的扩展应用

十一、智能化未来

• AI 过滤算法：深度网络自动去除散射与噪声，浓度误差 < 1 %。

• Lab-on-Chip：微流控整合稀释、检测、数据上云，单次样本 < 20 nL。

• 手机级 MEMS 光谱仪：在田间或病房即可完成 DNA 定量，配合蓝牙上传 LIMS 系统。

• Edge-AI 监控：连续发酵产 DNA 酶制剂过程中，边缘运算模块实时预测浓度曲线并调节补料量。

十二、结语

紫外吸收定量法以“最快速、最经济、最少样本损耗”的优势，仍是核酸研究与生产链条中不可或缺的基础工具。只要掌握 正确稀释、比值判读、杂质排查 三大关键，外加 微量光程 & 数据质控 两大加成，即可把 DNA 浓度测定误差控制在 ±2 % 以内，为下游实验提供坚实起点。随着 MEMS、AI 与 IoT 技术持续植入，紫外法将在未来的“智慧实验室”和“连续流生产”场景中焕发新的生命力。