紫外分光光度计

紫外分光光度计可用于蛋白质测定吗？

蛋白质是生物医药、功能食品、发酵工程和结构生物学的核心分析对象。紫外分光光度计（UV-Vis）作为实验室最普及的光谱设备之一，既被当作“浓度快检器”，也可升级为“品质哨兵”和“在线传感器”。

产品详细

一、紫外吸收机理：为什么蛋白质“看得见”

芳香族残基吸收

色氨酸 (Trp)：λ_max≈ 280–282 nm，ε≈ 5 500 L mol⁻¹ cm⁻¹
酪氨酸 (Tyr)：λ_max≈ 274–276 nm，ε≈ 1 440
苯丙氨酸 (Phe)：λ_max≈ 257 nm，ε≈ 200

肽键吸收

n → π* 跃迁，λ≈ 190–205 nm，ε≈ 10 000（但溶剂与杂质易干扰）

二硫键/金属配合吸收

提供次要吸收带，与折叠状态相关，可用于质构监测

朗伯–比耳定律
$A=εclA=\varepsilon c l$
在 0.05 ≤ A ≤ 1.2 区间近似线性，光程 l 可为 1 cm（常规）或 0.05–0.2 mm（微量平台）。

**简言之：**只要配方里有 Trp/Tyr（大部分蛋白如此），280 nm 就能测得可量化的光吸收；没有芳香残基时，可用 205 nm 补位。

二、三套定量路线：从速测到精测

1. 280 nm 直接法（最常用）

适用对象	优点	局限
绝大多数含 Trp/Tyr 蛋白	无化学反应，30 s 内出结果	缺乏 Trp/Tyr 的胶原、明胶及小肽测值偏低

经验转换系数

$mL−1)=A280ε1%280C(\text{mg mL}^{-1})=\frac{A_{280}}{\varepsilon_{1\%}^{280}}$

其中 ε₁%^{280} 为“1 mg mL⁻¹ 时，1 cm 光程下的吸光度”，可用序列推算或文献查表。

2. 205 nm 全肽键法（无芳香残基首选）

公式 (Scopes)
$mL−1)=A20531C(\text{mg mL}^{-1}) = \frac{A_{205}}{31}$
优势：对胶原蛋白、多肽水解液等低芳香族样本同样敏感；
要点：需要石英比色器，且溶剂必须无深紫外吸收（如硫酸铵必须稀释）。

3. 双波长／差示法（蛋白-核酸混杂体系）

两条方程
$CDNA\begin{cases} A_{280}=1.55\,C_{\text{Prot}}+0.76\,C_{\text{DNA}}\\ A_{260}=0.27\,C_{\text{Prot}}+1.00\,C_{\text{DNA}} \end{cases}$
用途：分子克隆、质粒纯化时可一次读出DNA与蛋白两浓度。
实现：代入实测 A₂₈₀、A₂₆₀ 求解二元线性方程即可。

三、样品前处理与光程选择

样品	光程 / 器皿	典型稀释	特殊操作
发酵液上清	10 mm 石英槽	20×–100×	0.22 µm 过滤，去散射
高浓度抗体原液	0.1 mm 微量槽	无需稀释	去气泡 / 温控 25 ℃
口红配方蛋白	石英比色+乙醇萃取	5×–10×	去脂+离心除蜡
胶原水解液	1 mm 半微槽（205 nm）	2×–5×	比色皿用新鲜酸洗

精髓：让 A 落入“线性甜区”并把散射、浊度、色度降至最低。光程短、样量少、结果更稳。

四、质量控制：5 + 1 标准

指标	要求	核心检点
线性	R² ≥ 0.998	标曲至少 5 点，跨度 20–120 %
精密度	RSD ≤ 2 %	同一样品 6 读
准确度	回收率 95–105 %	加标三水平
特异性	A_blank ≤ 0.01	缓冲与溶剂匹配
稳定性	2 h 偏差 ≤ 3 %	避光、恒温
波长校验(＋1)	K₂Cr₂O₇ 257/313 nm 比值合格	每周一次

五、与经典比色法的正面对比

维度	UV-直读	Bradford	BCA	Lowry
测试时间	0.5 min	25 min	30 min	90 min
样品消耗	1–2 µL（微槽）	200 µL	200 µL	200 µL
试剂成本	无	★	★★	★★
染料残留	无	有	Cu²⁺残留	重金属残留
动态范围	0.02–200 mg mL⁻¹	1–2 000 µg mL⁻¹	20–2 000	50–1 500
干扰因子	核酸、盐、缓冲	去垢剂敏感	还原剂敏感	酚敏感

**结论：**日常高通量快检 → 用 UV；痕量检测或缺芳香残基 → 补用 BCA/Bradford。两者合用可覆盖从 µg mL⁻¹ 到百 mg mL⁻¹ 全范围。

六、数据异常与补救清单

症状	判定	应急方案
A₂₈₀ > 1.5，曲线平顶	浓度过高	稀释 5–20× 或换 0.1 mm 光程
A₂₆₀/A₂₈₀ > 0.7	核酸混杂	加 DNase/RNase 消化后重测
A₂₆₀/A₂₈₀ < 0.5	酚/色素引入	酚/氯仿抽提或活性炭吸附
全谱尾拖长	微粒散射	过滤／离心或加 0.05 % Tween-20
测值随机漂	比色窗留残	70 % 乙醇＋无尘纸彻底擦拭

七、紫外法的“进阶玩法”

动态检测折叠/展开

变性剂梯度（6 M GuHCl→0）实时记录 280 nm，可绘 Tm 曲线。

Stopped-Flow UV

监测酶‐配体快速结合（ms 级）中的色氨酸荧熄或 λ 移。

在线光纤探头

发酵罐出口安装 280 nm 探头，配 PID 曲线实时调节补料。

深紫外圆二色

同步测吸光 + 二级结构，用于蛋白药质控。

AI‐Denoise

深度网络自动剔除散射与噪声，低浓样本 S/N 提升 3-5 倍。

八、未来技术坐标

技术	关键突破	应用场景
MEMS-UV 芯片	深紫外 LED + 微光栅	手持快检，高通量 QC
微流控前处理	集成稀释、过滤、光程可调	连续制造产线
云端光谱数据库	万级蛋白 ε 值与全谱指纹	字典式比对、一键溯源
AI 反演模型	全谱 → 浓度 + 高阶结构预测	疫苗与单抗结构监测

九、结语

能测吗？ 当然能。80 % 以上的蛋白质含 Trp/Tyr，可直接以 280 nm 读数乘“经验系数”定量。
准不准？ 通过光程匹配、稀释线性、比值监控和杂质排查，可把变异压到 ±2 %。
值不值？ 对于需要 “秒级反馈”“微量损耗”“在线闭环” 的场景，UV‐直读法拥有不可替代的高性价比；与比色法、质谱法互补，可覆盖全浓度范围与质量维度。

紫外分光光度计虽老，但在 MEMS、智能算法与物联网的加持下，正快速升级为智慧生物制造与实验室自动化体系中的“一线哨兵”。熟练掌握其机理与操作细节，便能在蛋白质分析的竞赛中跑赢时间与成本。

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