测量样品前需要进行哪些准备？
样品准备 ≈ 数据质量 70% 的控制手段。
粗放式直接上样虽然能测出读数，但准确度、重复性、灵敏度、稳定性全部打折扣。
完善的准备工作不仅提高单次数据质量，还可极大节省重复实验的返工成本
一、为什么样品前处理至关重要？
紫外分光光度计遵循的是光程短、灵敏高、干扰多、容错低的物理规律。由于紫外测量对光学纯净度、溶液均一性、散射与杂质的敏感性极强，因此：
样品准备 ≈ 数据质量 70% 的控制手段。
粗放式直接上样虽然能测出读数，但准确度、重复性、灵敏度、稳定性全部打折扣。
完善的准备工作不仅提高单次数据质量，还可极大节省重复实验的返工成本。
二、完整样品准备流程总览
复制编辑样品收集 → 初步处理 → 预稀释 → 脱气除泡 → 澄清净化 → 平衡温度 → 光程适配 → 比色池加载
每一步背后都有明确物理/化学机制支撑。以下逐一详细解析。
三、样品准备具体操作步骤
1. 样品收集与保存
| 关键点 | 技术说明 | 错误后果 |
|---|---|---|
| 采集清洁 | 无析出容器、避光避热 | 分解、氧化、沉淀 |
| 临时保存 | 2–8 ℃ 冷藏，pH 稳定 | 降解、多肽裂解 |
| 长期保存 | –20 ℃ 冷冻、配稳定剂 | 活性降低、聚集 |
**注意：**避免使用玻璃容器存放有机溶剂萃取物，硅溶出可能干扰深紫外吸收。
2. 初步处理（针对复杂基体）
| 样品类型 | 必须前处理 |
|---|---|
| 生物样本 | 离心除胞外基质（10 000 g, 5 min） |
| 乳液/乳品 | 稀释 + 稳定剂 (如 0.01% SDS) |
| 色素类 | 活性炭吸附或 SPE 固相萃取 |
| 油脂类 | 乙醇或甲醇预萃取去除非极性组分 |
**原则：**先剔除可能对吸光度、散射产生贡献的物理杂质。
3. 稀释体系设计
核心目标：让最终吸光度落入 0.1–1.0 AU 线性区。
3.1 经验换算公式
稀释倍数=预估浓度×ε×l目标A\text{稀释倍数} = \frac{预估浓度 × \varepsilon × l}{目标 A}稀释倍数=目标A预估浓度×ε×l
3.2 稀释液选择原则
同样 pH、离子强度与样品一致；
用 UV 级水或 HPLC 级溶剂；
避免含表面活性剂 unless 已验证无干扰。
3.3 移液注意事项
使用校准移液器（误差 ≤ 0.5%）；
反向移液技术减少吹出误差；
每支枪头只使用一次，避免交叉污染。
4. 脱气除泡程序
| 方法 | 操作条件 | 适用场景 |
|---|---|---|
| 真空脱气 | –0.1 MPa × 10 min | 水样、缓冲液 |
| 超声脱气 | 40 kHz × 5 min | 蛋白、多肽 |
| 氮气慢吹 | 0.5–1 L/min × 3 min | 有机萃取物 |
**目标：**避免光程不稳、散射峰错位、重复性波动。
5. 澄清净化措施
| 操作 | 适用条件 |
|---|---|
| 0.22 µm 微孔过滤 | 凡可滤液体 |
| 10 000 g 离心 5 min | 颗粒性沉降物多 |
| SPE 固相萃取柱 | 共吸收色素多 |
**注意：**过滤膜材质须与溶剂兼容（如有机溶剂避用 PES 膜）。
6. 温度平衡与物理稳定
实验室恒温 20–25 ℃；
样品静置 ≥ 10 min 保证各稀释液平衡；
同时准备空白液同步温度平衡。
**物理机理：**折光率、表面张力、溶解氧含量均随温度微变，影响吸收。
7. 光程匹配与比色池适配
| 样品浓度等级 | 光程建议 | 适用比色池 |
|---|---|---|
| 高浓 | 0.1–1 mm | 微量比色片 |
| 中浓 | 1 cm | 标准石英比色池 |
| 低浓 | 5 cm | 长光程石英槽 |
比色池管理
每天使用前：70% 乙醇 → 超纯水 → 干燥
每月检查：目视划痕、气泡附着区
每季度换新：高强度使用
8. 上样与加载技巧
| 操作细节 | 防差错逻辑 |
|---|---|
| 缓慢上样 | 防止气泡卷入 |
| 避头部液滴 | 枪头尾段吸液，避免吹泡 |
| 均匀铺展液面 | 保持光程一致性 |
| 轻敲比色池 | 破除微泡附着 |
微光程平台特殊措施
移液头预润 3 次；
确保液体完全覆盖窗面；
测前 10 秒观察液柱完整性。
四、不同检测项目下的特殊准备补充
| 检测类型 | 特殊处理 |
|---|---|
| DNA 浓度测定 | RNase 消除RNA污染；A260/A280 比值实时判读 |
| 蛋白定量 (280 nm) | 过滤除胶体碎片，稀释后再测 |
| 药品含量测定 | 药典建议：5–10 点标准曲线；重稀释打在工作浓度中心区 |
| 食品色素 | SPE 固相柱除杂色；稀释系数标准化 |
五、样品准备质量控制清单
| 检查点 | 判定标准 | 频次 |
|---|---|---|
| pH 测定 | ±0.05 误差内 | 每批次 |
| 溶剂空白吸光度 | A≤0.02 AU | 每次测量前 |
| 移液器校准 | 容量误差 ≤0.5% | 每月 |
| 滤膜完整性 | 无撕裂、无断面 | 每批换新 |
| 比色池透光率 | ≥99.5% | 每季度 |
六、智能化未来样品准备
| 技术 | 优势 | 实现形式 |
|---|---|---|
| 全自动移液平台 | 系统移液 + 混匀一体 | 液面感知模块 |
| 智能排泡系统 | 微流控自动排气泡 | 气液界面电阻检测 |
| AI 样品监测 | 样品澄清度即拍即判 | 光学+图像识别算法 |
| 智能比色池识别 | 自动光程记录 | NFC 内置芯片 |
未来趋势：让样品准备成为“全封闭、零手工、高一致性”的自动流程。
七、结语
好样品=好数据
UV-Vis 是一种“看得见一切微瑕疵”的工具，任何操作马虎都会在吸光度上被无限放大。准备流程=实验成功的保险
严格控制样品收集、纯化、稀释、排泡、温度与光程，全流程内控，可让 UV 测量误差稳定 ≤1%。标准化=实验室效率乘法器
将本文每个子流程写入实验室SOP，长期执行下来，你会看到：测量合格率↑
重复性提升↑
操作员培训成本↓
法规审核通过率↑
