
测量样品前需要进行哪些准备?
一、样品准备的地位与意义
在紫外分光光度计的整个分析过程中,样品准备质量直接决定了最终数据的可靠性与准确性。
紫外法属于高灵敏度、低耐受性的检测技术,任何前期准备上的微小瑕疵,都会在吸光度读数上被放大:
少量颗粒物 → 散射干扰;
微小气泡 → 光程异常;
溶液不均匀 → 重复性差;
稀释误差 → 定量失真。
结论: 样品准备不是可选项,而是整个分析系统的关键前提条件。
二、完整的样品准备总体框架
复制编辑样品采集 → 保存与运输 → 初步纯化 → 稀释调配 → 除气澄清 → 温度平衡 → 比色池管理 → 上样检查
每一环节都是误差源头控制节点。以下逐一详细展开。
三、样品采集与保存
操作环节 | 技术要点 | 风险控制 |
---|---|---|
容器选择 | 玻璃/高纯聚丙烯管 | 避免溶出物与紫外吸收干扰 |
采集工具 | 经高纯清洗 | 防止采样时引入颗粒污染 |
保存条件 | 避光、冷藏 2–8℃ | 抑制降解与沉淀 |
长期储存 | –20℃冷冻配稳定剂 | 防止蛋白聚集与氧化产物生成 |
注意: 采集与保存阶段管理不善,将造成无法逆转的成分变化。
四、样品预处理与初步纯化
4.1 适用样品分类
样品类型 | 必做处理 |
---|---|
血清血浆 | 高速离心去蛋白沉淀 |
乳品饮料 | 稀释去脂+稳定剂保护 |
植物提取物 | 固相萃取去除共吸收色素 |
药品复方制剂 | 分离辅料干扰成分 |
4.2 纯化技术工具
技术 | 作用 | 适用场景 |
---|---|---|
离心 | 去除大分子杂质 | 悬浮液/组织匀浆 |
微孔过滤 (0.22μm) | 澄清小颗粒 | 蛋白定量/核酸分析 |
固相萃取 (SPE) | 脱色除杂 | 色素类药品 |
凝胶过滤 | 保持活性同时除杂 | 蛋白质精制 |
重点: 样品澄清度越高 → 后续吸光度噪声越低 → 检出限更优。
五、样品稀释体系设计
5.1 确定目标吸光度区间
推荐范围:0.1–1.0 AU
超出1.5 AU可能产生非线性吸收误差。
5.2 稀释液选择原则
与样品溶剂体系一致;
使用UV级纯水或高纯溶剂;
含有缓冲盐、pH调节剂时保持与样品一致性。
5.3 移液技术规范
操作要点 | 防错逻辑 |
---|---|
校准移液枪 | 确保每支枪的准确性 |
反向移液法 | 减少高表面张力液体误差 |
独立枪头 | 防止交叉污染 |
缓慢吸排液 | 避免涡流卷入气泡 |
六、除气排泡处理
6.1 气泡干扰表现
瞬时吸光度跳动;
重复性差异剧烈;
微光程平台尤为敏感。
6.2 排泡技术手段
方法 | 适用场景 | 操作说明 |
---|---|---|
真空脱气 | 水基溶液 | –0.1MPa,10–15分钟 |
超声排泡 | 蛋白多肽类 | 40kHz,3–5分钟 |
慢速氮气吹扫 | 易挥发有机体系 | 0.5L/min缓慢吹扫3分钟 |
6.3 上样操作技巧
倾斜加载,避免落液冲击;
枪头头部液滴切勿吹残,防止挂壁;
上样后轻敲比色池排残余气泡。
七、温度平衡控制
7.1 温度效应机理
因素 | 影响表现 |
---|---|
折光率变化 | 改变光程一致性 |
气泡析出 | 液体溶解气体释放 |
分子构象 | 蛋白质稳定性波动 |
7.2 控温操作
样品与空白提前放置实验室常温20–25℃平衡15分钟;
复杂体系建议使用流通恒温系统维持光路温度恒定。
八、比色池准备与管理
8.1 光程匹配逻辑
浓度等级 | 推荐光程 | 适用器材 |
---|---|---|
高浓度 | 0.1–1mm | 微光程平台 |
常规浓度 | 1cm | 标准石英比色池 |
低浓度 | 5cm | 长光程石英槽 |
8.2 比色池维护流程
乙醇清洗 → 超纯水漂洗 → 气流干燥;
每季度检查光透过率与划痕情况;
长期使用需统一编号避免混用老化比色池。
九、空白溶液准备同步进行
成分与样品体系一致(溶剂、缓冲液、pH、电导一致);
脱气除泡;
在测定前同步预热平衡温度。
提示: 任何空白溶液与样品体系稍有偏差,都会造成基线偏移与吸光度误判。
十、预设仪器参数文件准备
仪器设定项目 | 推荐值 | 说明 |
---|---|---|
波长扫描范围 | 200–400nm | 根据样品 λmax 确定 |
步长 | 0.5–1nm | 建峰型完整 |
带宽 | 1nm | 保障灵敏度与分辨力平衡 |
积分时间 | ≥1秒 | 增强信噪比 |
扫描速度 | 中速 | 减少漂移误差 |
特别强调: 所有测样前需完成基线扫描、空白扣除与系统自检通过。
十一、不同分析项目下样品准备要点总结
项目 | 关键准备差异 |
---|---|
核酸分析 | RNase去除污染、260/280比值校验 |
蛋白定量 | 溶液澄清、加缓冲剂防聚集 |
药品定量 | 稀释倍数精确、辅料扣除处理 |
环境监测 | 固相萃取预富集、过滤除微粒 |
食品添加剂 | 显色反应完全、背景一致性良好 |
十二、实验记录要求与合规接口
记录模块 | 内容要素 | 法规要求 |
---|---|---|
样品信息 | 批次号、制备日期、操作者 | 质量可追溯性 |
配液记录 | 标准品称量与溶液体积 | 方法验证合规 |
移液日志 | 移液器编号与校验日期 | 精密度控制 |
排泡记录 | 排泡时间与方法描述 | 数据完整性 |
比色池管理 | 编号与光透过率检查 | 仪器适用性验证 |
符合ISO17025、ICH Q2、USP<857>、GMP、21 CFR 11等国际法规标准
十三、智能化样品准备平台趋势
技术模块 | 功能优势 | 实验价值 |
---|---|---|
智能移液平台 | 自动精确稀释、混匀 | 消除人工误差 |
在线脱气模块 | 真空-超声复合排泡 | 提高澄清度与稳定性 |
AI视觉检测 | 气泡识别与报警 | 防止上样隐性干扰 |
样品追溯条码管理 | 全过程数字记录 | 质控合规性提升 |
十四、结语总结
样品准备决定了紫外分光光度计分析的数据可信度天花板。
从采样保存到移液排泡、控温管理、比色池使用,每一环节都需要标准化与严格执行。
标准化流程+操作习惯养成+智能化辅助三位一体,才是现代紫外实验室高效、精准、稳定的数据质量保障体系。
