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测量样品前需要进行哪些准备?

在紫外分光光度计的整个分析过程中,样品准备质量直接决定了最终数据的可靠性与准确性。

一、样品准备的地位与意义

在紫外分光光度计的整个分析过程中,样品准备质量直接决定了最终数据的可靠性与准确性

紫外法属于高灵敏度、低耐受性的检测技术,任何前期准备上的微小瑕疵,都会在吸光度读数上被放大:

  • 少量颗粒物 → 散射干扰;

  • 微小气泡 → 光程异常;

  • 溶液不均匀 → 重复性差;

  • 稀释误差 → 定量失真。

结论: 样品准备不是可选项,而是整个分析系统的关键前提条件。


二、完整的样品准备总体框架

复制编辑样品采集 → 保存与运输 → 初步纯化 → 稀释调配 → 除气澄清 → 温度平衡 → 比色池管理 → 上样检查

每一环节都是误差源头控制节点。以下逐一详细展开。


三、样品采集与保存

操作环节技术要点风险控制
容器选择玻璃/高纯聚丙烯管避免溶出物与紫外吸收干扰
采集工具经高纯清洗防止采样时引入颗粒污染
保存条件避光、冷藏 2–8℃抑制降解与沉淀
长期储存–20℃冷冻配稳定剂防止蛋白聚集与氧化产物生成

注意: 采集与保存阶段管理不善,将造成无法逆转的成分变化。


四、样品预处理与初步纯化

4.1 适用样品分类

样品类型必做处理
血清血浆高速离心去蛋白沉淀
乳品饮料稀释去脂+稳定剂保护
植物提取物固相萃取去除共吸收色素
药品复方制剂分离辅料干扰成分

4.2 纯化技术工具

技术作用适用场景
离心去除大分子杂质悬浮液/组织匀浆
微孔过滤 (0.22μm)澄清小颗粒蛋白定量/核酸分析
固相萃取 (SPE)脱色除杂色素类药品
凝胶过滤保持活性同时除杂蛋白质精制

重点: 样品澄清度越高 → 后续吸光度噪声越低 → 检出限更优。


五、样品稀释体系设计

5.1 确定目标吸光度区间

  • 推荐范围:0.1–1.0 AU

  • 超出1.5 AU可能产生非线性吸收误差。

5.2 稀释液选择原则

  • 与样品溶剂体系一致;

  • 使用UV级纯水或高纯溶剂;

  • 含有缓冲盐、pH调节剂时保持与样品一致性。

5.3 移液技术规范

操作要点防错逻辑
校准移液枪确保每支枪的准确性
反向移液法减少高表面张力液体误差
独立枪头防止交叉污染
缓慢吸排液避免涡流卷入气泡

六、除气排泡处理

6.1 气泡干扰表现

  • 瞬时吸光度跳动;

  • 重复性差异剧烈;

  • 微光程平台尤为敏感。

6.2 排泡技术手段

方法适用场景操作说明
真空脱气水基溶液–0.1MPa,10–15分钟
超声排泡蛋白多肽类40kHz,3–5分钟
慢速氮气吹扫易挥发有机体系0.5L/min缓慢吹扫3分钟

6.3 上样操作技巧

  • 倾斜加载,避免落液冲击;

  • 枪头头部液滴切勿吹残,防止挂壁;

  • 上样后轻敲比色池排残余气泡。


七、温度平衡控制

7.1 温度效应机理

因素影响表现
折光率变化改变光程一致性
气泡析出液体溶解气体释放
分子构象蛋白质稳定性波动

7.2 控温操作

  • 样品与空白提前放置实验室常温20–25℃平衡15分钟;

  • 复杂体系建议使用流通恒温系统维持光路温度恒定。


八、比色池准备与管理

8.1 光程匹配逻辑

浓度等级推荐光程适用器材
高浓度0.1–1mm微光程平台
常规浓度1cm标准石英比色池
低浓度5cm长光程石英槽

8.2 比色池维护流程

  • 乙醇清洗 → 超纯水漂洗 → 气流干燥;

  • 每季度检查光透过率与划痕情况;

  • 长期使用需统一编号避免混用老化比色池。


九、空白溶液准备同步进行

  • 成分与样品体系一致(溶剂、缓冲液、pH、电导一致);

  • 脱气除泡;

  • 在测定前同步预热平衡温度。

提示: 任何空白溶液与样品体系稍有偏差,都会造成基线偏移与吸光度误判。


十、预设仪器参数文件准备

仪器设定项目推荐值说明
波长扫描范围200–400nm根据样品 λmax 确定
步长0.5–1nm建峰型完整
带宽1nm保障灵敏度与分辨力平衡
积分时间≥1秒增强信噪比
扫描速度中速减少漂移误差

特别强调: 所有测样前需完成基线扫描、空白扣除与系统自检通过。


十一、不同分析项目下样品准备要点总结

项目关键准备差异
核酸分析RNase去除污染、260/280比值校验
蛋白定量溶液澄清、加缓冲剂防聚集
药品定量稀释倍数精确、辅料扣除处理
环境监测固相萃取预富集、过滤除微粒
食品添加剂显色反应完全、背景一致性良好

十二、实验记录要求与合规接口

记录模块内容要素法规要求
样品信息批次号、制备日期、操作者质量可追溯性
配液记录标准品称量与溶液体积方法验证合规
移液日志移液器编号与校验日期精密度控制
排泡记录排泡时间与方法描述数据完整性
比色池管理编号与光透过率检查仪器适用性验证

符合ISO17025、ICH Q2、USP<857>、GMP、21 CFR 11等国际法规标准


十三、智能化样品准备平台趋势

技术模块功能优势实验价值
智能移液平台自动精确稀释、混匀消除人工误差
在线脱气模块真空-超声复合排泡提高澄清度与稳定性
AI视觉检测气泡识别与报警防止上样隐性干扰
样品追溯条码管理全过程数字记录质控合规性提升

十四、结语总结

  • 样品准备决定了紫外分光光度计分析的数据可信度天花板

  • 从采样保存到移液排泡、控温管理、比色池使用,每一环节都需要标准化与严格执行。

  • 标准化流程+操作习惯养成+智能化辅助三位一体,才是现代紫外实验室高效、精准、稳定的数据质量保障体系。