一、重复性的基本概念与意义

1.1 什么是重复性？

**重复性（Repeatability）**指在相同实验条件下（同一操作者、同一仪器、相同环境、相同样品）短时间内重复进行测量时，各次结果之间的一致程度。它是实验方法可靠性的基本体现。

1.2 为什么重复性重要？

• 验证数据可信度：可区分偶然误差和真实信号；

• 确保质量控制：在制药或工业检测中，重复性不良会导致批次不合格；

• 优化实验条件：通过分析差异来源，改进操作流程；

• 支撑科学结论：研究报告的数据必须可重复，才能被接受或验证。

二、重复性评价的常用方法

要判断紫外分光光度计的重复性，可以采用以下几种策略：

2.1 吸光度的多次测量

选取同一样品，在相同设置条件下重复测定其吸光度（Abs）。通常测量次数为3–6次，然后对数据进行统计处理。

示例：

2.2 计算标准偏差（Standard Deviation, SD）

公式如下：

SD=1n−1∑i=1n(Ai−Aˉ)2SD = \sqrt{\frac{1}{n-1} \sum_{i=1}^{n}(A_i - \bar{A})^2}SD=n−11i=1∑n(Ai−Aˉ)2

其中 AiA_iAi 为第 i 次测量吸光度，Aˉ\bar{A}Aˉ 为平均值，n 为测量次数。

2.3 计算相对标准偏差（RSD）

更直观的重复性判断指标是相对标准偏差：

RSD(%)=SDAˉ×100%RSD(\%) = \frac{SD}{\bar{A}} \times 100\%RSD(%)=AˉSD×100%

一般认为：

• RSD < 0.5%：重复性优异；

• 0.5% ≤ RSD < 1.0%：重复性良好；

• RSD ≥ 1.0%：重复性较差，需查明原因。

三、样品测量重复性测试流程

3.1 仪器初始化

• 开机预热至少20分钟；

• 选择合适的波长（如最大吸收波长λmax）；

• 设置测量模式为“吸光度”；

• 校正基线，归零。

3.2 样品配置一致

• 样品溶液应浓度均匀，充分混匀；

• 使用相同的比色皿，体积、光程一致；

• 保持样品体积恒定；

• 每次测量前清洗比色皿并确认其干净透明。

3.3 重复操作

• 在相同条件下连续多次测量吸光度；

• 每次取样和插入比色皿方式尽量一致；

• 记录所有测量数据；

• 用上述方法计算RSD。

四、影响重复性的常见因素及排查方法

4.1 操作误差

• 比色皿未对齐光路：造成吸光度不稳定；

• 操作手法不一致：如注液速度、插拔比色皿动作粗暴；

• 液面高度差异：影响光程稳定性；

• 指纹或灰尘污染光窗：影响透光性。

建议：保持操作标准化，使用同一批次耗材并按流程规范操作。

4.2 仪器误差

• 光源老化：氘灯或钨灯输出不稳；

• 检测器灵敏度下降：需定期校准；

• 机械部件松动：如比色皿架位置不准。

建议：定期维护和校准仪器，确保其处于最佳运行状态。

4.3 样品溶液问题

• 浓度不均匀：溶液未充分溶解或分层；

• 混浊或沉淀：散射光干扰吸光度；

• 有气泡存在：会反射或折射光线，误导测量。

建议：使用超声波脱气、离心或过滤等方法确保样品稳定均匀。

4.4 环境因素

• 温度波动：影响样品吸收性质；

• 光照干扰：强烈环境光可能干扰光路；

• 湿度过高：可能对比色皿造成影响或仪器电路短路。

建议：选择稳定、干燥、无强光的实验环境。

五、定量分析中重复性的应用

在紫外分光光度计用于浓度测定时，重复性好坏将影响最终标准曲线的拟合效果。具体表现如下：

5.1 标准曲线构建

将不同浓度的标准溶液进行多次测定，记录吸光度与浓度的关系并绘图，构建线性方程：

$$A=kC+b$$

若每点数据RSD较小，则曲线线性度高（R²接近1），说明重复性佳。

5.2 样品浓度计算的稳定性

若对某一未知样品重复测量5次，其所得浓度差异极小（如±0.002 mg/mL），则说明分析方法具备良好重复性。

六、重复性与精密度的关系

重复性是“精密度（Precision）”的一部分。精密度分为三类：

因此，重复性是对实验系统稳定性最直接的评价手段，是构建完整验证体系的第一步。

七、增强重复性的操作建议

1. 使用同一批次试剂与耗材：减少批次差异；

2. 固定操作顺序：形成标准化流程；

3. 建立SOP文件：操作人员严格按照流程执行；

4. 采用自动比色皿转换器：避免人为误差；

5. 进行批间对比验证：观察不同样品批次的波动性。

八、常见问题与处理方式

九、案例分析：蛋白质280 nm吸收的重复性测定

某实验室使用紫外分光光度计测量牛血清白蛋白（BSA）溶液的280 nm吸光度。每次测量取样自同一储液瓶，使用石英比色皿测定结果如下：

平均值为 0.8736，标准偏差为 0.0011，RSD为 0.13%，说明仪器状态良好，样品一致性高，操作规范，具备极好重复性。

十、结语

重复性是紫外分光光度计分析方法可靠性的重要表现之一。科学评估重复性不仅有助于提升实验数据质量，还能反映出实验操作是否规范、仪器状态是否稳定。通过合理的实验设计、精细的操作控制、严谨的数据处理与合理的误差分析，我们能够全面而准确地判断紫外分光光度计的测量重复性，进而为科学研究与质量控制提供坚实的数据基础。