如何制作吸收标准曲线？
一、理论基础
1.1 朗伯-比尔定律（Beer–Lambert Law）
紫外分光光度法的基础是朗伯-比尔定律：
A=ε⋅b⋅cA = \varepsilon \cdot b \cdot cA=ε⋅b⋅c
其中：
AAA 为吸光度；
ε\varepsilonε 为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）；
bbb 为比色皿光程（一般为1 cm）；
ccc 为溶液浓度（mol/L）。
根据此定律，在一定波长范围内、浓度适宜时，吸光度与浓度成正比。
1.2 标准曲线的意义
实现定量分析：将未知样品的吸光度代入曲线方程可求其浓度；
验证实验系统线性范围；
检查仪器性能是否稳定。
二、实验前准备
2.1 仪器与材料
石英比色皿（适用于200–800 nm）；
精密天平、移液器、容量瓶；
分析纯级别标准品；
溶剂（如蒸馏水、缓冲液、乙醇等）；
数据处理软件（Excel、Origin、仪器自带软件等）。
2.2 实验环境要求
光照稳定、温度20–25℃；
台面水平无震动；
保持清洁，防止样品交叉污染。
三、标准溶液的配制
3.1 标准品的选择
选择具有代表性且稳定的标准物质。常见如：
钾重铬酸盐（K₂Cr₂O₇）；
过氧化氢（H₂O₂）；
硝酸钴、硫酸铜等金属盐；
有机色素（如甲基橙、酚红）；
蛋白质（如BSA）或核酸（用于生化实验）。
3.2 浓度梯度设置
通常选取5–8个浓度点，并符合以下原则：
最低点接近零（或空白）；
浓度均匀递增；
覆盖目标分析浓度范围；
每点浓度误差小于±1%。
3.3 溶液稀释方法
以原液（如1000 mg/L）为母液，用移液管和容量瓶进行定容稀释。例如：
| 浓度（mg/L） | 吸取母液体积 | 定容体积 |
|---|---|---|
| 2 | 0.2 mL | 100 mL |
| 4 | 0.4 mL | 100 mL |
| … | … | … |
务必使用相同的溶剂与空白液体保持一致性。
四、测量步骤
4.1 仪器设置
打开紫外分光光度计并预热（20–30分钟）；
选择合适测量模式（Abs）；
设定波长（一般选最大吸收峰λmax）；
归零：插入空白溶液比色皿并进行“Blank”调零操作。
4.2 样品测定
用石英比色皿装入标准溶液；
每次测定均擦拭比色皿光窗；
保持液面一致；
从低浓度到高浓度依次测量，避免污染；
每种浓度建议测量2–3次，取平均值。
4.3 记录数据
如下：
| 浓度（mg/L） | 吸光度（Abs） |
|---|---|
| 0（空白） | 0.000 |
| 2 | 0.110 |
| 4 | 0.218 |
| 6 | 0.326 |
| 8 | 0.430 |
| 10 | 0.538 |
五、绘制标准曲线
5.1 使用Excel绘图
打开Excel，输入浓度与吸光度数据；
插入“散点图”；
添加趋势线（选“线性趋势线”）；
勾选“显示公式”和“R²值”；
获取回归方程如：
A=0.0538C+0.0011(R2=0.9996)A = 0.0538C + 0.0011\quad (R^2 = 0.9996)A=0.0538C+0.0011(R2=0.9996)
5.2 用Origin绘图
导入数据；
使用“Linear Fit”工具；
可生成线性拟合方程并导出图片。
5.3 曲线线性评估
**斜率（k）**表示灵敏度；
**截距（b）**理论上接近零；
相关系数R²越接近1越好，通常R² ≥ 0.998为优秀。
六、计算未知样品浓度
将未知样品测得的吸光度代入回归方程，求出浓度。例如：
若某样品吸光度为0.312，代入：
C=A−bk=0.312−0.00110.0538≈5.78 mg/LC = \frac{A - b}{k} = \frac{0.312 - 0.0011}{0.0538} ≈ 5.78 \text{ mg/L}C=kA−b=0.05380.312−0.0011≈5.78 mg/L
如样品有稀释，记得乘以稀释倍数。
七、误差来源与修正方法
| 误差类型 | 来源 | 修正方法 |
|---|---|---|
| 系统误差 | 比色皿污染、光路偏移 | 清洗、校准 |
| 操作误差 | 稀释误差、移液不准确 | 使用校准移液器、重复操作 |
| 浓度非线性 | 浓度过高偏离朗伯比尔定律 | 适当稀释，扩大线性区间 |
| 波长不稳定 | 光源老化、波长漂移 | 更换氘灯或重新校准 |
| 温度变化 | 吸光度受温度影响 | 保持室温恒定 |
八、曲线精度与重现性评估
8.1 计算RSD
对重复测量的吸光度值计算相对标准偏差（RSD）判断重现性：
RSD=SDAˉ×100%RSD = \frac{SD}{\bar{A}} \times 100\%RSD=AˉSD×100%
通常RSD < 1% 被认为良好。
8.2 多批次对比
若制作多批标准曲线，可比较其斜率是否一致，判断方法重复性。
九、案例：水样中重铬酸钾浓度测定
目的：测定地表水中重铬酸钾浓度。
操作：
以K₂Cr₂O₇为标准品，配制0–10 mg/L的标准液；
在350 nm测定吸光度；
测量标准吸光度，绘制标准曲线；
测定未知样，吸光度为0.452；
得出浓度为8.33 mg/L，确认污染水平超标。
十、总结
制作吸收标准曲线是紫外分光光度计定量分析的关键步骤，包含从样品配置、测量操作到数据拟合全过程。一个高质量的标准曲线不仅能提供准确、可靠的分析基础，还体现出实验设计的规范性和操作人员的专业水平。掌握标准曲线的制作方法，是每位实验技术人员不可或缺的技能之一。
