一、引言

紫外分光光度计是一种以物质对紫外或可见光的吸收为基础进行分析的仪器。它广泛用于定量检测溶液中目标组分的浓度。然而，在具体操作中，样品浓度范围的合理选择是决定实验是否成功的关键之一。浓度太高会超出仪器的线性响应范围，导致吸光度饱和；浓度太低则信号微弱、受噪声干扰。因此，科学设置样品溶液的浓度区间，不仅可以确保数据的准确性和重复性，还能延长仪器寿命和提升实验效率。

本文将全面探讨紫外分光光度计分析中样品浓度范围的确定方法，从基础原理到实际操作，逐步剖析浓度选择的逻辑和技术细节。

二、基础理论：朗伯-比尔定律

样品浓度与其吸光度的关系遵循朗伯-比尔定律（Beer–Lambert Law）：

$$A=\epsilon \cdot b\cdot c$$

其中：

• $A$：吸光度；

• $\epsilon$：摩尔吸光系数；

• $b$：光程长度（比色皿宽度，通常为1 cm）；

• $c$：溶液浓度（mol/L）。

在一定波长下，吸光度应当与浓度呈线性关系。然而，这一关系只有在一定浓度范围内成立，一旦浓度超出线性范围，吸光度不再正比于浓度，便会导致定量分析失真。

三、浓度范围设定的核心原则

3.1 线性响应范围

通常紫外分光光度计的线性响应区间为：

$$0.1\le A\le 1.0$$

在该区间内，仪器的响应最稳定，系统误差最小。部分高灵敏度仪器可扩展至0.05–1.5，但仍建议尽量控制在标准范围。

3.2 最小检测限（LOD）和定量限（LOQ）

• LOD：仪器能区分样品与空白的最小浓度；

• LOQ：能够进行准确定量分析的最小浓度。

选择浓度范围时，应高于LOQ，低于线性饱和点。

四、样品类型与浓度范围的关系

不同类型的样品，其可检测的浓度范围存在显著差异。如下表所示：

五、标准曲线法中的浓度选择步骤

5.1 预估吸光系数

查阅文献或使用先前数据预估物质的摩尔吸光系数，反推适合的浓度起点。

例如，若某物质在λ=280 nm的吸光系数为20000 L·mol⁻¹·cm⁻¹，为得到A=1：

c=Aε⋅b=1.020000⋅1=5.0×10−5 mol/Lc = \frac{A}{\varepsilon \cdot b} = \frac{1.0}{20000 \cdot 1} = 5.0 \times 10^{-5} \text{ mol/L}c=ε⋅bA=20000⋅11.0=5.0×10−5 mol/L

换算后为约 50 μM，可设浓度范围为 10–100 μM。

5.2 设置梯度浓度点

选择5～8个浓度点，使吸光度均匀分布于0.1–1.0之间。如：

• 设定浓度点为 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM；

• 测量吸光度后绘制标准曲线，确认线性良好；

• 在该区间内测定未知样品浓度最为理想。

六、实验操作对浓度准确性的影响

6.1 稀释精度

• 使用校准移液器配制标准溶液；

• 每次稀释误差控制在±1%以内；

• 建议使用10 mL、25 mL、100 mL容量瓶定容。

6.2 溶液稳定性

• 高浓度溶液易沉淀、聚集或分解；

• 样品若不稳定，应立即测定；

• 稀释后应充分混匀并快速操作。

6.3 过滤与去泡

• 高浓度溶液可能含有悬浮物或微泡；

• 应使用0.22 或 0.45 μm过滤器去除杂质；

• 微气泡可能导致光散射，应排除。

七、超浓度与低浓度样品的处理策略

7.1 浓度过高（吸光度 > 1.5）

处理方式：

• 适当稀释样品至吸光度在1.0以内；

• 使用更短光程（如0.5 cm）比色皿；

• 如使用扫描模式，确认光谱饱和区避免误读。

7.2 浓度过低（吸光度 < 0.05）

应对方法：

• 浓缩样品，延长测定时间（提高信噪比）；

• 使用更长光程比色皿（如5 cm）；

• 多点取样求平均，减小误差。

八、仪器设置对浓度范围的辅助作用

8.1 波长选择对灵敏度影响

• 选择吸收峰的最大波长（λmax）有利于增强信号；

• 次吸收波峰可能灵敏度不足，不适合定量分析。

8.2 滤波器与光源调节

• 氘灯适合紫外区，钨灯适合可见区；

• 应使用仪器自动选择或手动调节合适光源组合。

8.3 调整积分时间（Integration Time）

• 提高光源信号采集时间可增强低浓度信噪比；

• 不建议用于高通量实验，以免延误效率。

九、常见错误与误区分析

十、案例：核酸浓度测定浓度范围设定

背景

实验室拟使用紫外分光光度计测定RNA样品浓度，已知其在260 nm处具有明显吸收。

操作流程

1. 初步测定原液A260 = 2.8（远高于理想值）；

2. 设置稀释倍数为1:50、1:100、1:200；

3. 记录如下吸光度：

建议使用1:100稀释液作为测试浓度，最接近理想线性区（0.5–1.0）。

结果与分析

• 重复测定后RSD < 0.3%，稳定性良好；

• 浓度回算后与Qubit定量法接近，说明浓度选择正确。

十一、结语

在紫外分光光度计分析中，样品溶液浓度范围的合理设置是一项基础而关键的技术。它直接决定了分析数据的可靠性、重现性和分析效率。通过掌握吸光度线性规律、结合样品性质、参照文献数据，并合理进行实验设计与浓度梯度配置，用户可以准确而高效地获得所需的分析结果。

浓度设定看似简单，实则涉及物理、化学、光学多方面知识。操作人员应具备良好的实验素养和判断力，确保测量在理想范围内进行，为科学研究或质量控制提供坚实的数据支撑。