一、引言

在紫外分光光度法的操作过程中，基线校正（Baseline Correction）是一项基础而关键的技术环节。它是确保测量准确性和重复性的前提步骤。无论是在吸光度测量、光谱扫描还是定量分析中，只有先完成基线的正确设定，后续的实验数据才能具有科学价值。本文将全面讲解紫外分光光度计中基线校正的作用原理、操作方法、典型设置、仪器差异、常见误区与问题处理等，构建一套完整的技术指南。

二、什么是基线校正？

2.1 概念解析

基线校正，亦称“零点校正”、“背景校正”或“空白校正”，是指将样品未加入前的系统吸光信号设为参照值（通常设为0），以便在实际测量中剔除仪器、自身溶剂或比色皿引起的干扰，实现数据的净化。

2.2 目的与意义

• 消除仪器背景吸收；

• 剔除比色皿或溶剂的基线影响；

• 保证吸光度测定以样品信号为基准；

• 提高光谱扫描的解析度与对比度。

三、基线校正的原理基础

3.1 吸光度定义

根据朗伯–比尔定律：

A=−log⁡10(T)=log⁡10(I0I)A = -\log_{10}(T) = \log_{10} \left( \frac{I_0}{I} \right)A=−log10(T)=log10(II0)

其中：

• $A$：吸光度；

• $T$：透过率；

• I0I_0I0：入射光强；

• $I$：样品透过光强。

基线校正的目的即是将 I0I_0I0 设为参比，以便将样品测得的 $I$ 与其比对，得到真实吸光度值。

四、进行基线校正的时机

基线校正不是一次性操作，而是在特定情况下必须重新执行：

• 更换比色皿或调整位置后；

• 改变波长或扫描范围后；

• 修改测量模式（如从Abs改为%T）后；

• 更换溶剂或分析系统后；

• 仪器预热初期或出现漂移时。

五、标准操作流程

以下为通用的基线校正操作步骤（适用于大多数型号）：

步骤一：打开仪器并完成预热

• 打开主电源；

• 开启紫外/可见光源（氘灯、钨灯）；

• 等待15–30分钟直至光强稳定。

步骤二：设定测量模式与波长

• 选择“Abs”或“%T”；

• 如进行光谱扫描，设定起始波长与终止波长；

• 若测量单波长，设定具体数值（如260 nm、280 nm等）。

步骤三：插入空白比色皿

• 使用与样品相同体积与溶剂；

• 保证比色皿干净无划痕、气泡；

• 放置方向一致，光学窗口对准光路。

步骤四：执行校正命令

• 在界面点击“Blank”或“Zero”；

• 仪器将记录当前透过率为100%或吸光度为0；

• 等待几秒，提示“校正完成”或“基线稳定”。

步骤五：取出空白，插入样品比色皿

• 重新插入待测样品；

• 进行吸光度测定或扫描操作。

六、光谱扫描模式下的基线校正

在扫描模式（如全波段扫描、动力学扫描）中，基线校正涉及整个波长范围。

6.1 单点 vs 多点校正

• 单点校正：在扫描开始前使用空白液体设置基线；

• 多点校正：在扫描多个样品之间重复设置，以防系统漂移。

6.2 自动 vs 手动基线修正

• 高端仪器（如岛津 UV-2600）可自动识别空白样本并执行；

• 普通仪器需人工插入比色皿并点击校正按钮。

七、特殊情况的基线处理

7.1 双波长法校正

适用于背景干扰强的分析项目，通过设置参考波长与测量波长之间的差值剔除非特异性吸收。

• 例：设置主波长为340 nm，参考波长为405 nm；

• 系统自动计算吸光差值：A₃₄₀ – A₄₀₅。

7.2 动态扫描校正

在时间扫描中，应在起始点先进行空白校正，确保吸光度随时间变化不受初始误差影响。

八、不同品牌仪器中的基线操作差异

九、错误示范与处理建议

十、实验室SOP建议模板（摘要）

基线校正操作规程概要：

1. 仪器启动与光源预热；

2. 设置波长/扫描区间；

3. 插入空白溶液比色皿；

4. 点击“Blank/Zero”执行；

5. 待系统提示“完成”后开始测量；

6. 每组样品测定前均应重复校正；

7. 出现系统误差应重新启动系统并校正。

十一、案例解析

案例一：DNA浓度测定前的基线偏移问题

背景：某实验室使用紫外分光光度计测定DNA在260 nm下的吸光度，但空白校正后仍出现偏高背景。

分析：

• 所用空白为去离子水，而DNA溶液配制于TE缓冲液；

• 溶剂基质不一致导致比色误差。

解决：

• 统一使用TE缓冲液作为空白校准基准；

• 重新执行基线校正，吸光度恢复正常。

案例二：光谱扫描图基线非水平

背景：学生实验中扫描获得的吸收曲线整体向上偏移。

原因：

• 空白液体中混入微量杂质；

• 比色皿光窗未清洗干净，影响光透过率。

解决：

• 使用新配制空白液，重新清洁比色皿；

• 执行全波段基线校正，曲线恢复正常。

十二、结语

基线校正是紫外分光光度计实验中不可或缺的步骤之一，它直接影响到后续吸光度的真实性与浓度计算的准确性。科学而规范的基线校正可有效消除系统误差、提升数据质量、增强实验可重复性。

良好的实验习惯应当将基线校正视为每次测量的“开场白”。无论是日常检测、教学实训，还是高精度科研实验，基线是否“干净稳定”，往往决定了数据是否“有说服力”。