样品溶液的浓度范围如何选择？
一、引言
紫外分光光度计是一种常用于物质定量分析的光学仪器，其核心原理依赖于样品在特定波长下对紫外或可见光的吸收特性。然而，测量的准确性与稳定性高度依赖于样品浓度是否处于仪器的线性响应区间。若浓度过高或过低，不仅会使吸光度值偏离理论线性区，甚至可能导致无法得出有效读数。
因此，科学合理地选择样品溶液的浓度范围，是确保定量测定准确性和方法可靠性的重要步骤。本文将从理论基础、仪器性能、实验规范和案例分析等多个维度，系统讲解如何确定紫外分光光度计分析中的浓度范围。
二、紫外分光光度法的理论依据
2.1 朗伯-比尔定律回顾
紫外分光光度法的定量分析建立在朗伯-比尔定律基础上：
A=ε⋅b⋅cA = \varepsilon \cdot b \cdot cA=ε⋅b⋅c
其中：
AAA：吸光度（无单位）
ε\varepsilonε：摩尔吸收系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）
bbb：比色皿光程，通常为1 cm
ccc：样品浓度（mol/L）
在一定浓度范围内，吸光度与浓度呈严格的线性关系。然而，在过高或过低浓度条件下，这一线性关系会发生偏移，导致分析误差。
三、仪器线性范围与吸光度区间
3.1 吸光度线性范围的建议值
| 吸光度值范围 | 说明 |
|---|---|
| 0.1–1.0 | 最佳线性范围，误差小，灵敏度高 |
| 0.05–1.5 | 一般可接受的线性响应范围 |
| <0.05 | 信号微弱，噪声影响大，误差高 |
| >1.5 | 光线穿透率低，偏离线性，需稀释样品 |
3.2 仪器相关参数影响
不同品牌和型号的紫外分光光度计具有不同的检测器灵敏度与线性区间。以下为常见仪器参数影响：
| 品牌型号 | 推荐吸光度范围 | 备注 |
|---|---|---|
| 岛津 UV-1800 | 0.1–1.2 | 具备自动动态范围调整 |
| Agilent Cary 60 | 0.05–1.5 | 高动态范围、适合弱吸收检测 |
| 普析 TU-1901 | 0.1–1.0 | 国内常规实验室仪器 |
四、如何确定浓度范围：核心步骤
步骤一：选择测定波长（λmax）
λmax处吸收最强、灵敏度最高；
可通过全波扫描或参考文献获取；
λmax的选定决定了样品的摩尔吸收系数（ε），从而影响浓度选择。
步骤二：初步浓度范围估算
通过对照品或预实验数据，初步判断浓度与吸光度的对应关系：
假设λmax处ε = 1.2×10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹，要求A ≈ 1.0，则：
c=Aε⋅b=1.01.2×104⋅1=8.3×10−5mol/Lc = \frac{A}{\varepsilon \cdot b} = \frac{1.0}{1.2 \times 10^4 \cdot 1} = 8.3 \times 10^{-5} \text{mol/L}c=ε⋅bA=1.2×104⋅11.0=8.3×10−5mol/L
即浓度控制在8×10⁻⁵ mol/L附近。
步骤三：制作标准曲线梯度
选取5–7个浓度梯度点；
浓度跨度应覆盖预计的样品浓度±30%；
各点吸光度落在0.1–1.0区间内。
五、过高或过低浓度的风险与处理
5.1 浓度过高（吸光度 > 1.5）
| 问题 | 解决策略 |
|---|---|
| 光线穿透率下降，信号偏离线性 | 将样品稀释至目标浓度 |
| 多峰吸收区域可能被遮蔽 | 更换测量波长或缩短光程 |
| 比色皿内壁可能因沉淀污染造成误判 | 检查样品溶解度并过滤处理 |
5.2 浓度过低（吸光度 < 0.05）
| 问题 | 解决策略 |
|---|---|
| 信噪比低，误差大 | 浓缩样品或延长积分时间 |
| 仪器背景漂移影响明显 | 采用双光束仪器或扣除空白 |
| 重复性差，标准曲线R²值不理想 | 选择更灵敏的波长或方法 |
六、样品浓度调控方法与技巧
6.1 使用标准溶液定量稀释
配制高浓度母液，使用容量瓶逐级稀释；
避免直接稀释至目标浓度，减少误差；
每次稀释使用不同移液器具，防止交叉污染。
6.2 采用透射比法判断稀释倍数
若吸光度超出线性范围，可通过多次稀释对比吸光度是否成比例；
吸光度比值与稀释倍数成正比，验证线性响应是否保持。
6.3 浓缩样品方法
适用于低浓度生物样品：
| 方法 | 说明 |
|---|---|
| 旋转蒸发 | 除去溶剂，提高溶液浓度 |
| 冷冻干燥 | 尤其适用于热敏性提取物 |
| 固相萃取 | 去除杂质，提升目标组分浓度 |
七、根据样品类型调整浓度范围
| 样品类型 | 推荐浓度范围 | 特殊说明 |
|---|---|---|
| 药品分析 | 0.01–0.10 mg/mL | 符合药典规定，便于线性回归 |
| 蛋白质测定 | 0.1–1.0 mg/mL | 280 nm，易受干扰，需精确控浓度 |
| 茶多酚分析 | 0.02–0.12 mg/mL | 波长274 nm，吸收强，适中浓度最佳 |
| 色素检测 | 1–10 μg/mL | 需稀释至适合线性段 |
| 工业废水 | 需前处理后稀释至0.05–1.0 mg/L | 光谱复杂，需注意干扰物质存在 |
八、案例分析
案例一：样品吸光度超限
背景：某次药品溶液检测，吸光度为2.3，无法读取。
处理：
将原样品稀释10倍重新测定，吸光度降至0.25，位于理想范围内，数据纳入标准曲线计算。
案例二：样品重复性差
现象：样品A重复测定吸光度为0.037、0.041、0.034，RSD偏大。
分析：浓度偏低，信号弱。
措施：浓缩至原体积的1/2，重复测定后吸光度为0.086，RSD降低至0.7%。
九、误区分析与纠正
| 误区 | 正确做法 |
|---|---|
| 所有样品浓度越高越好 | 浓度应控制在线性响应范围 |
| 高浓度样品无需稀释 | 测量前必须确保A ≤ 1.0 |
| 低吸光度样品可通过修改公式计算 | 信噪比差导致不可靠，应适度浓缩 |
| 所有样品用相同稀释倍数处理 | 应根据初测数据灵活调整 |
十、总结与建议
紫外分光光度计的样品浓度设定，是整个定量分析过程的起点。浓度过高将导致非线性响应和光程遮挡，浓度过低则会使信号被噪声淹没。合理的浓度控制策略应依据：
仪器性能；
λmax与吸收强度；
实验所需精度；
样品稳定性与可重复性。
建议：
进行初测，建立浓度–吸光度对应关系；
使用标准曲线验证浓度适宜性；
遇异常读数时优先考虑浓度设定问题。
只有将样品浓度调控纳入实验系统性管理，才能保证数据的科学性、稳定性与可追溯性。
