如何进行基线校正？
一、引言
在紫外分光光度计分析中，“基线”看似是一个不被重视的参数，实则是确保数据准确性的关键“光学底线”。基线漂移会影响整个波长扫描的吸光度基准，直接干扰谱图、浓度计算和曲线拟合。
基线校正（Baseline Correction） 的本质，是“归零”紫外-可见光谱中所有非样品吸收的背景干扰，使测量结果仅反映待测组分的光吸收特征。科学、规范的基线校正是每一次紫外光谱测定必须执行的重要步骤。
二、什么是基线校正？
2.1 基线的定义
基线是指在没有待测样品的情况下，仪器所记录的光谱信号。它包括：
光源波动
检测器本底噪音
比色皿折射与吸收
溶剂或空白介质的吸收
2.2 基线校正的目的
基线校正的主要目的是扣除非分析目标带来的信号干扰，使测得的光谱图或吸光度值真正反映样品特征。未进行或错误进行基线校正，会导致：
吸光度偏高或偏低；
谱图“上漂”或“下压”；
标准曲线线性失真；
浓度计算误差增大。
三、基线漂移的原因与表现
| 原因类别 | 描述 |
|---|---|
| 仪器因素 | 灯源老化、光电转换器热噪、机械稳定性差等 |
| 比色皿因素 | 壁面残留、指纹、水渍反光、劣质皿材质影响透光性 |
| 操作因素 | 空白液不纯、比色皿放置歪斜、测量时间过长 |
| 软件设定 | 扫描前未重设基线，使用旧参数或缓存残留信号 |
表现形式
扫描光谱出现平滑但系统性上扬或下降；
空白样品曲线不为0；
多次测量基线不重合；
浓度值出现负数或不符合趋势。
四、基线校正的原理与类型
4.1 单点基线校正
仅在某一设定波长（如λmax）进行吸光度“清零”。常用于单波长定量测定。操作简便，但不能消除波长段的系统误差。
4.2 多点基线校正
在扫描模式中使用起始和终止波长两点或多个波长点进行校正，使整段基线平稳为“0线”。适用于吸收光谱绘制、定性分析。
4.3 自动基线功能（软件算法）
部分高端仪器内置自动校正模块，可在扫描过程中实时对比空白与样品信号，对偏差自动修复。用户只需选中“Baseline correction”选项。
五、基线校正的标准操作流程
5.1 准备阶段
| 步骤 | 操作建议 |
|---|---|
| 仪器预热 | 开机后预热光源20–30分钟，稳定输出 |
| 比色皿选择 | 选用配套优质石英比色皿，清洁后干擦 |
| 空白溶液准备 | 与样品溶剂完全一致，确保无色透明 |
| 比色皿注液 | 使用移液器慢速注液，避免气泡干扰 |
5.2 校正操作（以扫描模式为例）
将空白液体加入比色皿，放入样品室；
启动扫描程序，选择起始波长和终止波长（如200–400 nm）；
在软件中点击“Baseline”或“设置基线”按钮；
系统记录空白的吸收数据作为“零线”；
完成后取出空白比色皿，换入样品测定。
六、品牌软件中的基线校正操作举例
| 仪器品牌/型号 | 软件名称 | 基线设置方式 |
|---|---|---|
| 岛津 UV-2600 | UVProbe | 进入“光谱扫描” → 点击“基线测量” → 自动校正整段 |
| 安捷伦 Cary 60 | Cary WinUV | 选择“Collect Baseline”，系统提示空白位置与确认 |
| 普析 TU-1901 | UVWin | 主界面直接提供“建立基线”按钮，确认空白后执行校正 |
| Thermo Evolution | INSIGHT | 在“Scan Parameters”中勾选“Baseline Correction”功能 |
七、常见错误与异常处理
7.1 未使用正确空白液
问题：空白液不同于样品使用溶剂，吸光差异造成曲线基线偏移。
解决：确保空白与样品溶液配方完全一致。
7.2 比色皿污染
问题：空白样品本身为零，但污染物吸收造成虚假偏移。
措施：使用镜头纸彻底擦拭比色皿内外壁。
7.3 自动校正未完成
问题：未等待扫描完成或中途更换比色皿，导致基线校正失败。
建议：执行基线时避免其他操作，确保校正完整写入内存。
7.4 多次扫描后未重新校正
表现：同一样品扫描两次，谱线不重合。
操作：每次样品更换或环境变动后均应重新基线校正。
八、基线校正后的验证方法
8.1 扫描空白样品图谱
将空白溶液重复测定；
若曲线波动在 ±0.002 A 内，基线可认为稳定；
若超出该值，建议重新校正并检查比色皿状态。
8.2 测量标准品稳定性
使用已知吸收值的标准溶液；
若在历史值 ±2% 内，可认为基线可靠；
超出则需追溯基线校正或仪器状态。
九、特殊场景下的基线处理
9.1 双波长差吸收法
在某些检测中，通过两波长吸光差值计算浓度：
ΔA=Aλ1−Aλ2\Delta A = A_{\lambda1} - A_{\lambda2}ΔA=Aλ1−Aλ2
必须在两个波长点都完成基线校正，以免偏差叠加。
9.2 浊度高样品（如蛋白、生物液）
易出现散射背景；
可设置“光学基线拟合”功能，采用数学模型拟合空白趋势。
9.3 多样品连续扫描
推荐每10个样测一次空白，进行插值修正；
使用软件进行批量曲线矫正与漂移补偿。
十、案例分析：基线校正影响结果的实例
案例一：维生素C波长扫描基线偏高
情况：样品谱图比标准谱图整体偏上0.05 A。
原因：空白液中加入了少量杂质（误加了试剂水而非去离子水）。
措施：
重新配制空白溶液；
重做基线校正，谱图回归正常。
案例二：蛋白吸收峰不清晰
背景：BSA在280 nm处应出现明显吸收峰，但谱线弯曲。
分析：基线设置不当，未勾选“多点基线拟合”，导致低波段误差大。
修正：更改为200–400 nm段自动多点校正后，谱线清晰恢复。
十一、实验规范建议与质量控制
| 项目 | 建议设置/动作 |
|---|---|
| 基线频率 | 每次开机后、每批样品前、每次样品类型更换后 |
| 空白液保存 | 每天新配，使用同批溶剂 |
| 比色皿使用记录 | 建立编号体系，定期校验透光率 |
| 校正记录 | 软件自动保存或人工记录基线执行时间与参数 |
| 定期比对标准光谱 | 确保仪器性能与基线功能长期一致 |
十二、结语
基线校正虽看似一个“小步骤”，但却是紫外分光光度计精密测量中不可或缺的基础环节。通过对仪器状态、空白液、比色皿以及操作流程的全面掌握和控制，实验者可以确保每一次测量结果都建立在真实、可靠的光学基准之上。
在追求数据准确性和方法重复性的现代分析环境中，规范而科学地执行基线校正，是每一位实验人员专业素养的体现，也是实验室质量管理的基本保障。
