一、引言：从“光”到“浓度”的科学桥梁

紫外分光光度计（UV-Vis Spectrophotometer）是一种利用紫外与可见光穿透样品的方式，探测物质对不同波长光的吸收程度，从而进行成分分析与定量测定的仪器。该技术的核心是光学吸收现象，其基本工作原理融合了物理学中的光传播、分光、吸收机制与现代电子信号处理。

本文将围绕紫外分光光度计的工作流程、光路设计、吸光定律、光电信号转换与数据输出五个维度，系统剖析其基本原理，并结合示意图与典型应用，帮助理解仪器为何能“看见不可见”。

二、基本原理概述

紫外分光光度计的工作基础可以概括为一句话：

利用物质对特定波长光的吸收行为，测定其浓度或识别其种类。

关键的吸光过程遵循朗伯-比尔定律（Beer–Lambert Law），并通过以下过程实现信号转化：

1. 白光由光源发出；

2. 单色器筛选出特定波长；

3. 光穿过样品，部分被吸收；

4. 剩余光被检测器接收；

5. 仪器将光强变化转为吸光度，并通过程序换算出浓度。

三、核心光学路径与结构示意

复制编辑光源 → 单色器 → 样品池 → 检测器 → 模拟信号 → 数字化 → 显示结果

每一环节的作用：

四、朗伯-比尔定律：吸光度与浓度的数学桥梁

4.1 定律表达式：

$$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

• $A$：吸光度（Absorbance，无单位）

• $\epsilon$：摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）

• $c$：溶液浓度（mol/L）

• $l$：光程长度（cm，通常为1 cm）

4.2 物理意义：

• 吸光度反映了样品对入射光的吸收程度；

• 当波长固定时，吸光度与浓度成正比；

• 通过测定吸光度，即可反推出样品浓度。

4.3 应用前提：

• 光线必须是单色光；

• 吸收行为遵循线性响应范围（A = 0.1–1.0 最佳）；

• 样品均匀透明，光程固定。

五、单色器的作用：从“白光”提取“目标波长”

5.1 原理

• 使用光栅或棱镜分离复合光；

• 旋转调节结构使不同波长通过出射狭缝；

• 得到“带宽窄、波长稳定”的单色光。

5.2 示例

测定 DNA：选择 λ = 260 nm
测定蛋白质：选择 λ = 280 nm
测定铁离子–SCN⁻络合物：选择 λ = 510 nm

六、样品与吸收过程：分子对光的“选择性响应”

6.1 吸收机制

• 分子中的π电子、n电子或σ电子在吸收光能后跃迁；

• 紫外区主要涉及 π → π* 与 n → π* 跃迁；

• 吸收光能越高（波长越短），跃迁所需能量越大。

6.2 吸收峰

• 每种物质在特定波长有最大吸收峰（λmax）；

• λmax具有“指纹”特征，可用于定性分析。

七、光电转换：如何“看见”吸收程度？

7.1 剩余光的处理

• 光穿过样品后，未被吸收的光被检测器接收；

• 光强减弱的程度反映了吸光行为。

7.2 检测器功能

7.3 电信号转换

• 检测器将光强变化转为电流/电压信号；

• 信号经过放大、滤波、模数转换；

• 程序将信号换算为吸光度或浓度。

八、空白校正与透过率计算

8.1 为什么要空白校正？

• 比较样品与参比（空白）的吸收差异；

• 空白溶液仅含溶剂，无目标物质；

• 设定空白透过率为100%，即吸光度为0。

8.2 吸光度与透过率换算：

A=−log⁡T=−log⁡(II0)A = -\log T = -\log \left( \frac{I}{I_0} \right)A=−logT=−log(I0I)

• I0I_0I0：空白透过光强；

• $I$：样品透过光强；

• $T$：透过率（%）；

• $A$：吸光度。

九、扫描模式与图谱输出

9.1 定波长模式

• 固定波长进行单点检测；

• 快速测定目标浓度（如260 nm定量DNA）。

9.2 波长扫描模式

• 在一定范围内（如190–400 nm）连续变换波长；

• 输出吸收光谱图，显示各波长吸收强度变化；

• 用于识别 λmax 或多组分分辨。

9.3 应用示例

• 样品识别（是否为目标物质）；

• 多组分分离（峰分开说明混合物）；

• 稳定性观察（监测吸收峰漂移）。

十、实际应用案例解析

案例1：DNA浓度测定

• λmax：260 nm；

• 利用ε ≈ 6600 L·mol⁻¹·cm⁻¹；

• A260 = 1 对应约50 µg/mL DNA；

• 通过A260值快速获得核酸浓度。

案例2：食品中亚硝酸盐检测

• 显色反应后形成吸光团；

• λmax ≈ 540 nm；

• 比色测量吸光度，绘制标准曲线定量分析。

十一、影响测量结果的关键因素

十二、小结：从光的变化读出样品信息

紫外分光光度计将光学、电子、材料与计算融合，通过精准控制波长、稳定发射光线、准确接收信号，构建出一整套光与物质互动的量化体系。

它的工作原理基于光的吸收规律与数学建模的结合，其能力不仅在于检测浓度，更在于提供了结构识别、组分筛查与动力学研究的有力工具。