一、引言
紫外分光光度计（UV–Vis Spectrophotometer）因其快速、灵敏、无损、操作简便等优点，已成为化学分析、生物检测及质量控制领域的重要仪器。本文将重点比较其在药物纯度检测与生物大分子定量两大应用场景中的异同，包括实验原理、方法设计、样品前处理、校正与验证、数据处理及其优劣势等方面，旨在为实际应用提供参考。
二、实验原理与共同基础
朗伯–比尔定律
无论药物分析还是生物大分子定量，均建立在朗伯–比尔定律 A=εclA = \varepsilon c lA=εcl 之上，其中吸光度 AAA 与溶液浓度 ccc 呈线性关系。这一定律为测定未知样品浓度提供了理论依据。波长选择
核酸（DNA/RNA）在260 nm处有强吸收；
蛋白质芳香族氨基酸在280 nm处吸收；
样品中可同时测定260/280比值以评估纯度。
药物：根据化合物的特征吸收峰（常见于200–300 nm区间），选择最大吸收波长（λmax）以提高分析灵敏度与特异性。
生物大分子：
标准曲线法
均需配制一系列已知浓度的标准溶液，测量其吸光度，绘制吸光度–浓度曲线，进而求取未知样品的浓度。
三、药物纯度检测的特点
1. 法规和标准要求
药典规范：各国药典（如《中国药典》、USP、EP）对紫外法测定药物纯度有详细规定，涵盖波长精度、仪器校准、实验条件及允许偏差。
系统适用性测试（SST）：要求在分析前验证仪器波长准确度、基线噪声与漂移、带宽等性能指标。
2. 样品前处理
干燥与粉碎：固体药物需经干燥、研磨后均匀取样。
溶剂选择：需选用与药物溶解性匹配且无紫外吸收的溶剂（如水、甲醇、乙腈等）作溶媒。
稀释倍数：保证测得吸光度位于0.2–1.0范围内，以符合朗伯–比尔定律线性区间。
3. 干扰物的去除
杂质剥离：杂质可与主药物在相似波长处吸收，需通过适当前处理（液–液萃取、固相萃取）或多波长扫描法校正背景。
共吸收校正：采用双波长或三波长校正技术，以减小杂质或溶剂基线漂移的影响。
4. 方法验证
准确度：回收实验，添加已知量标准品于样品中，回收率应满足法规要求（一般在98–102%）。
精密度：重复测定（同一天内及不同日），相对标准偏差（RSD）需≤2%。
特异性：验证分析条件能区分主成分和相关物质，对流动相、溶剂和基质无干扰。
线性范围：在规定浓度区间内，相关系数 rrr 通常应≥0.999。
四、生物大分子定量的特点
1. 分子结构与吸收机制
核酸：碱基环系的共轭π键产生260 nm吸收峰，摩尔吸光系数可用于浓度换算。
蛋白质：主要由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族残基贡献280 nm吸收。
2. 样品前处理
缓冲体系：需选用对生物大分子无损害、紫外区几乎无吸收的缓冲液（如TE缓冲液、磷钾缓冲液），并保持pH稳定。
去除悬浮颗粒：采用0.22 μm滤膜或低温离心，避免颗粒引起散射干扰。
去除核酸／蛋白质降解产物：可使用蛋白酶（如Proteinase K）或核酸外切酶清除降解片段，保证测量对象的完整性。
3. 纯度评估指标
OD260/OD280比值：
纯核酸：约1.8–2.0；
纯蛋白质：约0.6–0.7；
异常比值提示蛋白质或酚盐污染。
背景扣除：用相同缓冲液作参比，扣除散射和缓冲吸收。
4. 方法验证
灵敏度：由于生物大分子常处于ng/μL–μg/μL水平，需检测下限足够低，一般要求检测限≤5 ng/μL。
重现性：同一样品多次测定，RSD通常需≤3%。
线性范围：浓度-吸光度相关系数应≥0.99；对于双峰分析（260和280 nm），需分别验证线性。
五、两者应用的主要相同点
依赖朗伯–比尔定律：均以吸光度与浓度线性相关为基础。
标准曲线构建：应用标准品进行定量校准。
样品处理流程：都包含稀释、混匀、去悬浮物等步骤。
仪器校准与性能检查：在分析前需完成波长校正、空白校正及系统适用性测试。
数据处理：需要记录吸光度值、计算浓度并评估偏差。
六、两者应用的主要不同点
| 对比维度 | 药物纯度检测 | 生物大分子定量 |
|---|---|---|
| 法规要求 | 严格遵循药典与ICH指南 | 实验室内部标准或文献方法，监管要求相对宽松 |
| 检测浓度范围 | μg/mL–mg/mL | ng/μL–μg/μL |
| 样品基质复杂度 | 多为纯化制剂或原料药，基质相对简单 | 细胞裂解液、血清、组织提取物等，基质复杂、干扰多 |
| 定量指标 | 含量测定、杂质和相关物质定量 | 样品浓度、纯度比值（OD260/280）、结合态评估 |
| 检测波长数 | 一般单波长或多波长扫描 | 通常至少两波长（260及280 nm），复杂时需全谱扫描以评估杂质 |
| 方法验证要点 | 特异性、准确度、精密度、稳定性、线性、检测限 | 灵敏度、线性、重现性、背景校正、降解产物干扰评估 |
| 前处理重点 | 除去溶剂、赋形剂及微量杂质 | 保持大分子结构完整、去除蛋白酶/核酸酶、缓冲体系匹配 |
七、应用案例对比
阿莫西林纯度测定（药物）
λmax = 272 nm；
标准曲线浓度范围：10–100 μg/mL；
回收率：99.2%–101.5%，RSD < 1.5%。
细胞总RNA定量（生物）
λ260/280比值：1.9；
检测限：5 ng/μL；
重复测定RSD：2.8%；
背景校正：用DEPC水空白扣除基线。
八、方法优劣势与注意事项
药物检测
优势：高特异、符合监管；
缺点：需严格溶剂纯度与杂质干扰控制。
生物大分子定量
优势：快速无损、可实时监测；
缺点：难以区分不同片段/同分异构体，需配合进一步电泳或荧光法验证。
九、结论与展望
紫外分光光度计在药物纯度检测与生物大分子定量领域均有广泛应用，但两者在法规要求、检测灵敏度、样品基质复杂度、定量指标与验证要点等方面存在显著差异。对于药物分析，需要更严格的特异性与准确度，而生物大分子定量更强调灵敏度和样品完整性。未来，伴随技术进步，在线微流控、纳米光谱增强、机器学习光谱分析等新兴手段有望进一步提升紫外分光技术在各领域的精度、通量与易用性。
