一、灭菌前的准备工作

1.1 熟悉设备结构

在进行灭菌操作前，操作人员应充分了解水套式CO₂培养箱的结构组成，包括：

• 内腔结构：观察是否有死角或积水区；

• 水套系统：了解水套水位线及加水口位置；

• CO₂传感器：确认其安装位置和保护方式；

• 加湿盘、水盘：明确其材质和清洁方法；

• 控制面板：熟悉灭菌模式（若有自动灭菌功能）及报警系统。

1.2 准备所需物品

• 无菌擦拭巾或70%-75%酒精；

• 高温高压灭菌器（如需处理可拆部件）；

• 无菌手套、口罩、工作服；

• 紫外线灯（如有需要）；

• 清洁剂（如中性皂液或专用仪器清洁剂）；

• 超纯水或去离子水；

• pH中性消毒剂（如季铵盐类）；

• 记录表格用于记录灭菌操作信息。

1.3 切断电源并断开气源

为确保安全，灭菌前应关闭培养箱电源并断开CO₂气体供应系统，防止操作过程中发生电气或气体泄漏意外。

二、手动灭菌操作流程

当设备不具备自动灭菌程序时，需人工完成以下操作步骤：

2.1 取出内部可移动部件

将培养架、托盘、水盘、加湿装置等可拆卸结构全部取出，送入高压灭菌器进行121℃、15-20分钟高压湿热灭菌。若器材不耐高温，可用75%乙醇或专用消毒液浸泡消毒30分钟后晾干备用。

2.2 清洁内腔表面

使用无尘布蘸70%-75%的酒精或其他低残留消毒剂彻底擦拭箱体内壁、角落、门封条、风道口等位置，尤其注意难以清洁的死角。擦拭后静置15分钟以确保充分消毒作用。

2.3 清洁传感器与控制系统周围

CO₂传感器及温湿度传感器一般不能用水直接擦拭，可用酒精棉签轻轻擦拭其外壳，并避免直接接触探头核心区域。部分设备需拆卸保护罩后进行操作，务必轻柔处理以免损伤。

2.4 清空水套并更换纯水

水套中的水易滋生细菌与藻类，建议定期（每月）排空并更换超纯水或去离子水。排水前可使用合适管道连接放水口，引流至废水桶中。清空后用新水冲洗2次以上再加注。若培养箱使用防藻剂，可按说明书加适量。

2.5 加湿盘消毒

加湿盘是细菌、霉菌繁殖的高风险区域，建议每周更换水并用消毒剂浸泡处理。处理后需以超纯水冲洗干净，避免消毒剂残留影响细胞生长。

三、自动高温灭菌模式操作（如设备具备该功能）

部分高端水套式CO₂培养箱配备自动高温干热灭菌功能，通常可达135℃，运行周期约为12小时。操作人员需严格按照以下流程操作：

3.1 检查内部是否清空

灭菌前必须取出所有细胞培养物、塑料制品、电子部件等不耐高温物体，以免损坏或污染环境。

3.2 启动灭菌程序

根据设备面板提示，进入灭菌程序，设置温度（一般为120-135℃）和时间（通常8-12小时）。设备将逐步升温、恒温、降温，并提示过程状态。

3.3 灭菌完成后的注意事项

灭菌结束后，待设备内部完全冷却（一般至少2小时）再打开舱门，以防热气伤人或温差引发冷凝水污染。开门后保持舱门敞开30分钟，确保干燥通风。

四、灭菌后复原与环境监控

4.1 恢复部件与设备连接

将所有灭菌完成的部件重新安装到位，并按顺序恢复CO₂管道连接，检查是否漏气。插上电源并启动设备，进行必要的校准操作（如温度、湿度、CO₂浓度校准）。

4.2 环境参数观察

在灭菌后第一次使用前，应运行培养箱至少8小时以确保其温度和CO₂浓度恢复稳定。在此期间，可放置CO₂检测仪或培养瓶模拟检测其参数是否稳定。

五、常见问题及应对措施

5.1 灭菌过程中产生异味或焦味

原因：消毒剂残留、塑料器件未清除、灰尘碳化等。

应对：检查设备内部是否有残留物，加大通风时间，并再次擦拭内部。

5.2 灭菌后箱内仍有水汽

原因：灭菌后未充分冷却或通风。

应对：开门通风，使用无尘纸巾吸干表面水滴，避免污染。

5.3 灭菌频率不当引起故障

建议频率：

• 日常擦拭：每周一次；

• 加湿水盘更换：每周；

• 全面灭菌：每月一次；

• 自动灭菌程序运行：每季度一次或视污染情况而定。

六、建立灭菌管理制度

为确保灭菌操作规范化、可追溯化，建议实验室建立以下制度：

• 灭菌日志记录表，记录操作时间、操作人、使用物品等；

• 污染监测记录，包括污染事件处理流程；

• 培训制度，新入职操作员须完成灭菌流程培训并通过考核；

• 定期维护计划，与厂商或设备工程师沟通维护周期及技术支持。

七、结语

水套式二氧化碳培养箱作为高精度、敏感性的实验设备，其内部环境的无菌状态直接关系到细胞实验的成败。规范的灭菌操作不仅是一项技术要求，更是一种对科研质量的责任体现。操作人员必须具备专业知识、操作规范意识和责任心，结合实验室制度管理，才能保障实验数据的科学性、重复性与安全性。