一、前言

酶联免疫吸附实验（ELISA）和其他基于酶标仪（酶标板读数仪）的生物化学检测广泛应用于疾病诊断、抗体筛选、药物研发等领域。无论是酶促反应底物显色、荧光探针检测，还是发光底物检测，都需要在微孔板中设置空白孔、阴性对照孔与阳性对照孔。合理的孔位布局能够有效降低板间位置效应（edge effect）、均衡温度与湿度分布、减少操作误差，从而提高实验结果的准确度与可重复性。本文将从整体设计思路、具体布局策略、注意事项与案例演示四个部分进行阐述，帮助实验者系统理解并灵活运用。

二、基础概念与作用

1. 空白孔（Blank Wells）

• 定义：仅加入反应缓冲液或底物缓冲体系，不含任何待测样本或酶、抗体等关键试剂，用于测量体系本底吸光度或荧光值，反映实验板读数对试剂本身、底物以及缓冲体系的背景信号。

• 作用：

• 校正底物及缓冲液的本底值，计算实际光密度（OD）或荧光强度。

• 监控整个反应体系中无特异性结合或非酶促产生的信号，为后续数据减去本底值提供依据。

2. 阴性对照孔（Negative Control Wells）

• 定义：加入与待测样本相同体积的封闭或空白样本（如无抗体的缓冲液、细胞培养上清、无靶分子组分等），但不包含能够产生特异反应的核心组分（如一抗、二抗或靶蛋白）。

• 作用：

• 评估非特异结合信号或背景噪声，反映样本基质及试剂在缺乏目标分子时的反应值。

• 用于计算信号与噪声比（S/N），帮助判断实验灵敏度与特异性。

• 检测实验操作中的污染或交叉反应，确保实验条件下无特异信号时读数接近零。

3. 阳性对照孔（Positive Control Wells）

• 定义：含有已知浓度的目标分子或标准阴阳性物质（如标准曲线用的已知浓度抗原、已验证的重组蛋白、标准抗体等），能够产生稳定、可预测的最高信号。

• 作用：

• 验证试剂性能和酶标仪读数的线性范围，确认检测体系灵敏度。

• 评估每次实验批次间的可重复性，通过比对阳性对照读数判断试剂或仪器性能是否异常。

• 用于构建标准曲线，推算样本中待测物浓度。

综上，三种对照孔在实验中各司其职：空白孔消除底物本底，阴性对照降低非特异信号干扰，阳性对照确保体系处于有效检出区间并构建定量标准。接下来重点讨论如何在96孔（或384孔）微孔板上安排这些对照孔位，以尽量减少环境与操作因素带来的误差。

三、布局设计原则

在确定对照孔时，需要结合以下三个方面的原则：

1. 板内均匀分布

2. 避开边缘效应区与温度梯度区

3. 操作便利性与板型适配

1. 板内均匀分布

• 避免集中摆放：如果将所有空白孔、阴性孔或阳性孔都集中在同一行或同一列，若该行或列存在定位误差、洗板不均匀或读板器通道缺陷，可能导致对照孔读数异常。应把对照孔分散在板内不同区域，以降低单一区域故障对整体数据带来的影响。

• 多个重复分区：建议将同一类型对照孔至少设置两组以上，比如在A1、H12（对角线两端）或B2、G11等对称位置各布置一组，以获得更具代表性的背景值或标准信号。即使局部出现信号偏差，也能通过其他位置的数据进行校正。

2. 边缘效应与温度梯度

• 边缘效应：

• 微孔板周边（特别是角落）由于与板外空气直接接触、更容易蒸发，或与读板器热源更靠近，可能出现信号偏高或偏低现象。

• 对照孔放置时，若全部置于边缘，则无法反映中心孔区的真实背景水平。因此，应尽量将核心对照孔分布在距离板边界至少一列或一行的位置（例如B2至G11区域），以减轻边缘效应。如果实验样本要求使用边缘孔（比如样本量很大时必须用满整板），则对照孔仍应分布在中心区为主，并在边缘区另设置与对照相对称的孔位，以便真实反映边缘与中心差异。

• 温度梯度：

• 放置在孵育箱或酶标仪读板器过程中，由于局部加热不均或预热不充分，中心区与边缘区可能存在温度差异，进而影响酶反应速度和信号强度。

• 可考虑在中心区与边缘区各设置一组对照，以评估温度梯度对读数的影响；同时在后续数据校正时，对中心区测值与边缘区测值进行独立扣除。

3. 操作便利性与板型适配

• 板型选择：

• 对于96孔板，通常采用12列 × 8行布局；为了满足对照分布原则，可在A1、H1、A12、H12等四个角落摆放对照孔，再在中心区均匀分布其他对照点。

• 对于384孔板（16 × 24），孔数增多，对照孔占比可适当提高；但布局原则相同：优先占中心区域并分散。

• 移液操作：

• 每一组对照孔的分散布局会增加移液器头的移动路径。为了减少多通道移液器取样误差，应将同一类型的对照孔尽量排列在相邻列或相邻行上，便于单次多通道移液完成。例如，在96孔板上，如果有8个空白孔，可先选择四角的两个，然后在中心选六个，以两两相邻的方式（如B2-B3、G10-G11）放置。

• 移液器兼容性：如果使用8通道移液器，一次性可平铺一整行或一整列操作。此时，可将某行（场）留作对照孔集中区，其他行用于样本或标准稀释梯度。然后通过板边标识提醒操作者该行只用于对照。

四、具体布局策略与示例

以下分别给出在96孔板和384孔板上常见的对照孔布局示例，并详细说明每种布局的优缺点。

1. 96孔板布局示例

1.1 布局示例一：四角+中心对称分布

mathematica复制编辑   列 →  1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12行 ↓A       空  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样   空B       样  阴  样  样  样  样  样  样  样  样  阴   样C       样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样   样D       样  样  空  样  样  样  样  样  样  样  样   样E       样  样  样  样  样  样  样  样  样  空  样   样F       样  样  样  样  阳  样  样  样  样  样  样   样G       样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样   样H       空  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样   空

• 说明：

• “空”（空白孔）布置在A1、A12、H1、H12四个角；

• “阴”（阴性对照）位于B2、B11两个对称位置；

• “阳”（阳性对照）仅在F5处设置一组，如果需要两组可在F8或C5对称；

• 其他位置为待测样本或标准系列。

• 优点：

• 空白孔分布在四角，能监测板边缘蒸发与仪器位置偏差；

• 阴性对照分散在近边缘与中心之间区域，可以反映整板非特异信号；

• 阳性对照在中心偏下位置，与空白、阴性对称分布，能够综合评估温度梯度与读板器光路影响；

• 板内剩余区可做梯度稀释或样本检测。

• 缺点：

• 阳性对照仅一组，若该孔出现异常无法分辨；

• 若使用单通道移液器，跨角移液耗时较长。

1.2 布局示例二：一列集中+分散凑数

mathematica复制编辑   列 →  1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12行 ↓A       空    空  样   样   样   样   样   样   样    样    阴    阴B       空    空  样   样   样   样   样   样   样    样    阴    阴C       样    样  样   样   样   样   样   样   样    样    样    样D       样    样  样   量   量   量   量   量   量    样    样    样E       样    样  样   量   量   量   量   量   量    样    样    样F       样    样  样   量   量   量   量   量   量    样    样    样G       样    样  样   量   量   量   量   量   量    样    样    样H       阳    阳  阳   样   样   样   样   样   样    阳    阳    阳

• 说明：

• “空”四个孔在A1、A2、B1、B2集中两列区域；

• “阴”放在A11、A12、B11、B12集中右上角两列；

• “阳”放在H1、H2、H11、H12以及H10、H3共计六个位置，呈现上下左右对称；

• “量”表示梯度或样本检测区。

• 优点：

• 利用8通道移液器可一次性在A行或H行完成多个空白/阴性/阳性布局，操作高效；

• 对照孔数量较多，具备更好的统计意义，可校正区域性误差；

• 缺点：

• 对照孔过多占据板位，减少样本检测孔数量；

• 集中在板边缘区域，中心区无对照，很难反映中心区温度漂移；

整体来看，示例一更能兼顾中心与边缘对照分布，防止集中布局带来的测量偏差；示例二适合对照需求量大、希望快速完成移液的场景，但需警惕边缘效应。

1.3 布局示例三：对角线及中心交叉分布

mathematica复制编辑   列 →  1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12行 ↓A       空  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  阴B       样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  阴  样C       样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样D       样  样  样  空  样  样  样  样  空  样  样  样E       样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样F       样  样  样  样  量  量  量  量  样  样  样  样G       样  阴  样  样  样  样  样  样  样  样  阴  样H       阳  样  样  样  样  样  样  样  样  样  样  阳

• 说明：

• “空”放在A1、D4、D9三个位置；

• “阴”放在A12、B11、G2、G11四个位置；

• “阳”放在H1、H12两个角和H5-H8（中心一行）另两组交叉；

• “量”表示标准曲线稀释梯度，从F5至F8。

• 优点：

• 对照孔与标准梯度、样本孔相互穿插，能同时评估四个象限区域的板内均一性；

• 中心区与对角线分布检查温度梯度与边缘效应；

• 缺点：

• 布局复杂，移液操作顺序需要提前规划；

• 若使用多通道移液器，需拆解多次移动，对操作者要求较高。

上表呈现“对角线+中心交叉”布局方式，适合需求定量精度极高、希望精细评估板上不同位置影响的高级实验。但日常常规实验推荐使用示例一的“四角+中心对称”方案。

2. 384孔板布局示例

对于384孔板，因孔位数量大、体积小、孔间距窄，边缘效应更为明显，布局更需谨慎。以下列举两种代表性思路，具体可根据实际需求灵活调整：

2.1 布局示例一：阵列化分区设计

假设采用16行（A–P）×24列（1–24）结构，将整板分为4个大区（每个大区96孔），每个大区再进行分散铺设对照。

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• 说明：

• 将384孔板划分为4个96孔区域（A–H/1–6、A–H/7–12、A–H/13–18、A–H/19–24），每一区域沿用96孔板“四角+中心”布局。

• 每96孔区域内都设有2个空白、2个阴性、2个阳性，并与相邻区保持对称性。

• 中心“量”区用于标准曲线梯度或关键样本检测。

• 优点：

• 每个96孔子区独立评估边缘效应，有助于大规模筛查时快速定位问题；

• 分区后仅需重复一次96孔布局方案，易于规划与执行；

• 对照数量相对充足，可兼顾板边与中心校正。

• 缺点：

• 对照孔总数较多，占用了约48个孔（每区12个×4区），减少样本通量；

• 384孔板对液体蒸发更敏感，需要严格控制蒸发防护（封板膜、湿箱孵育）。

2.2 布局示例二：中心避开边缘型

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• 说明：

• 全板边缘行（A、O、P）及边缘列（1、24）全部用于样本或标准，其余位置才分散设置对照；

• 空白孔（空）位于B9、D9、D17、G9、G17处，集中在中心区两侧；

• 阴性孔（阴）位于B2、B22、H2、H22、N2、N22；

• 阳性孔（阳）位于J2、J22、L2、L22、P9；

• “量”（标准系列）占据E5–F12区域与E13–F20区域。

• 优点：

• 边缘全部留给待测样本或标准，使样本通量最大化；

• 中心区域设置对照，能同时监测中心温度最稳定区与边缘样本信号间的差异；

• 384孔板孵育时，中心温度波动最小，对照孔集中放在中心可体现理想校正效果。

• 缺点：

• 边缘区域若出现信号异常，无对照校正，样本数据缺乏参照；

• 对照孔分散于中心，有时移液器定位易产生错位，需要特别小心。

五、布局注意事项与优化建议

除了上述示例和基本原则，以下几点也是设计时常被忽视但至关重要的细节。

1. 孔板批次与材料选择

• 高吸附 vs 低吸附：若实验使用高吸附板（如聚苯乙烯），则可能引入孔间非特异结合，建议在靠近边缘处额外增加阴性或假阴性对照，评估吸附背景。若使用低吸附板，可适当减少空白孔数量，让更多孔位用于样本检测。

• 透明度与荧光平衡：若同时进行吸光度与荧光检测，需确保空白孔测试对应的底物/荧光标记液，以便精确扣除双通道背景。

2. 热封膜与湿度控制

• 蒸发效应：边缘孔蒸发最为严重，可在使用前在板边加入适量的缓冲液或生理盐水，以形成“水墙”减缓蒸发；同时使用热封膜或加盖保持湿度。

• 湿度循环：若孵育器内部湿度不均衡，建议在每次实验前先在板内空白孔中加水或缓冲液，进行预孵育一段时间，让仪器环境达到平衡后再开始正式加样。

3. 移液器校准与操作规范

• 多通道移液器精度：若使用8通或12通道移液器，一次可以在同一行或同一列完成多孔加样，但需定期校准以保证准确度。建议定期进行吐吸测试或使用刻度吸头测量实际体积误差，误差过大时及时调整。

• 单通道移液器定位：若采用单通道移液器，排列表格与操作顺序要提前规划好，并尽量保持同一顺序（从左上到右下），减少手抖带来的定位误差。

4. 随机化与区块设计

• 随机化摆放：对于大批量样本检测，可先将全部样本编号随机打乱，然后在板上按照编号顺序摆放，以减少批次效应与孔位效应对实验组与对照组的系统性偏离。

• 区块设计（Block Design）：将整个板划分为若干小区（Block），在每个小区内包括相同实验组和对照组，通过对每个小区单独线性回归或标准曲线进行校正，进一步提高准确度。

5. 数据处理与质量控制

• 板间校正：如果对同一批样本在多块板上重复检测，需在每块板上都保留一组同样的阳性对照与空白孔，通过比对各板阳性对照吸光度或荧光值，计算校正因子，对样本读数进行板间标准化。

• 板内质量控制指标：常用CV（变异系数）、Zʹ因子（Z-prime factor）等指标评估实验质量。若某一孔读数偏离理论值较多（比如某个阳性对照孔读数低于平均值的80%），需剔除该孔或整块板，并重新实验。

六、案例分析与实战经验

为了让读者更直观理解对照孔位布局在真实实验中的作用，以下结合某实验室在进行人血清IgG定量ELISA时的实战经验进行说明。

1. 实验背景

某科研小组需要分析100份人血清样本中的IgG含量，采用96孔板ELISA检测法。实际应用中，研究人员发现板边缘信号普遍偏高，尤其是A、H行与1、12列所在孔位，导致部分样本结果偏离预期。为了解决这一问题，该团队在后续实验中进行以下优化：

2. 优化前布局

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• 空白孔：无空白孔；

• 阴性对照孔：C3、C11、E4、E9共四个；

• 阳性对照孔：无（使用标准曲线取样区已自带浓度梯度）；

• 问题：板边缘没有空白孔位，无法扣除边缘本底；阴性对照集中在中心区，无法监测边缘非特异信号；无独立阳性对照，标准曲线与对照曲线耦合，无法在阳性对照读数异常时进行即时判断。

3. 优化后布局

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• 空白孔：A1、A12、H1、H12四个角；

• 阴性对照孔：B2、B10两个对称；

• 阳性对照孔：在量区中随机选C4、E6、G8、D9排列四个等间距点，保证标准曲线区与阳性对照区分开；

• 标准曲线：从C4至C9进行六点梯度稀释，位于标准曲线区中心。

3.1 效果对比

• 边缘效应监测：四个空白孔所在角落读数差异明显，校正后边缘样本读数与中心样本读数更一致；

• 非特异信号扣除：阴性对照孔均匀分布在中心上方，能够及时反映试剂批次间非特异结合差异；

• 阳性对照监控：若阳性对照孔读数偏低，则提醒操作者查看酶标仪光源或底物是否失效，及时更换试剂；

• 数据稳定性：重复三次实验后，优化后板内CV<7%，优化前CV>12%，可见布局调整显著提高了实验一致性。

七、总结与建议

通过以上分析与实例，合理安排空白、阴性、阳性对照孔位涉及以下要点：

1. 分散对照孔位置：避免集中于某一区域或固定某几行列，应尽量在中心与边缘之间、板对角线与中轴线上均匀分布，平衡温度梯度与光路偏差。

2. 选择合适的对照数量：一般96孔板至少设置4个空白孔、4个阴性对照孔、2–4个阳性对照孔；384孔板可按比例适当增加，但仍需兼顾样本通量。

3. 避开极端边缘：边缘区域蒸发与温度波动最大，应减少对照孔集中在最外圈，最好至少留出一列/一行作样本或梯度区。

4. 与移液器操作相配合：若采用多通道移液器，可设计成“半行”或“半列”布局；若为单通道移液器，可在板边制备好简洁的移液路线或编号。

5. 预留板间校正对照：对多块板实验，可在每块板的相同孔位设置相同阳性对照，通过对比不同板次同一阳性对照的读数实现板间校正。

6. 考虑实验内容与检测模式：如果是荧光检测，需在对照孔加入合适荧光底物；如果为发光检测，需考虑发光底物稳定性与酶促反应时间，适当设置延迟读数或多次读取点。

最后，尽管本文提供了多种示例与思路，但每个实验室的设备型号、孵育条件、检测方式或试剂配比都有所差异，应根据具体情况进行微调。建议在正式大规模检测前，先做一次全板验证实验，对比不同对照布局下的板内CV、标准曲线线性度（R²值）与信噪比，选择最合适的方案。

八、附录：对照孔布局检查清单

1. 空白孔

• 至少4个（96孔板）或8个（384孔板），分布均匀；

• 在边缘与中心区域各占一部分；

• 加入与样本相同的缓冲体系或底物，但无酶促反应物。

2. 阴性对照孔

• 至少4个，最好分布在中心偏上的位置；

• 加入不含待测分子的阴性样本（缓冲或基质）；

• 用于检测非特异信号和操作污染。

3. 阳性对照孔

• 建议至少2个（96孔板）到4个（384孔板）；

• 加入已知浓度标准物质，使信号处于线性检测区间；

• 放置于中心或中心偏下区域，并与标准曲线分开。

4. 板边与中心平衡

• 板外圈仅少量对照或样本，避免边缘过多影响；

• 中心区应包含对照与标准系列，保证温度最稳定区域得到监控；

• 若使用热封膜或湿度箱孵育，确认上机前中心与边缘温度均衡。

5. 布局可操作性

• 标注好板式编号示意图，方便操作人员按照示意图加样；

• 多通道移液器时，优先考虑行脚布局；单通道移液器时，注意编号与移动顺序；

• 对照孔所在行/列特殊标记，防止错加样。

6. 数据分析注意点

• 读取仪器后先确认对照孔的读数是否在预期范围内；

• 空白孔平均值用于扣除背景，阴性对照取最大值做阈值线，阳性对照检查标准曲线斜率与R²；

• 若发现对照孔异常，及时记录并排除该板或该孔数据。

若能在每一轮实验前严格对照以上清单检查并布局，相信绝大部分由于孔位效应、温度漂移或操作误差导致的异常都能在对照孔层面及时发现并校正，最终获得更精准、可靠的酶标仪检测结果。