酶标仪读板器的扫描模式有哪些？
一、扫描模式的分类与基本原理
1.1 扫描模式的含义与体系结构
酶标仪扫描模式通常是指仪器在测量时如何依次或并行地对微孔板各孔进行光学信号采集，并通过软件算法解析获得数值或曲线。其核心包括硬件层面的光源激发与探测器接收，以及软件层面的波长选择、扫描步进、数据拟合算法等。可以粗略地将扫描模式分为三大维度：
检测类型维度：根据被测信号类型不同，可分为吸光度扫描、荧光扫描、发光扫描、时间分辨荧光（TRF）扫描、荧光共振能量转移（FRET）扫描、荧光偏振扫描等。
测定策略维度：从操作流程角度划分，有端点测定（Endpoint）、动力学测定（Kinetics）、斜率测定（Slope）、两点或多点相对测定（Dual/Multi Wavelength）、全波长扫描（Spectral Scan）、温度梯度扫描（Temperature Scan）等。
光路取样维度：包括顶读（Top Read）与底读（Bottom Read）、孔内区域扫描（Well Scan）与行列快速扫描（Plate Scan）。配合机械结构，还可细分为恒定位置测量与局部多点采样。
不同厂商和型号的酶标仪在硬件设计与软件算法实现上可能有所侧重，但大多结合以上三个维度进行组合，从而形成若干预置或可编程的扫描模式，适应多种实验需求。以下章节将对各类扫描模式展开详细阐述。
二、基于检测类型的光学扫描方式
2.1 吸光度（Absorbance）扫描
吸光度测定是最传统也是最常见的酶标仪检测方式，主要原理在于样本孔内某一物质（如染料、底物产物）在特定波长下对光的吸收强度与浓度之间存在线性或近线性关系。常用波长在340 ~ 750 nm 範围内，可结合单一波长或双波长（参考波长）进行测量。
单波长端点扫描（Single Wavelength End-Point）：仪器针对每个孔在预设固定波长处发射光束，检测透过光强，计算吸光度值。适用于酶促反应已结束、着色完全后的一次性测定。
双波长差值校正（Dual Wavelength Correction）：在样本孔易受背景干扰或基线漂移影响时，可在目标吸收峰波长和参考波长（通常为无显色吸收峰处）分别测量，再做差值以消除背景吸收，提升准确度。
全波长光谱扫描（Full Spectrum Scan）：部分高阶酶标仪可以在340 ~ 800 nm 范围内依次步进（如每2 nm），对每个孔进行光强扫描，获取完整光谱曲线，方便筛选最佳检测波长或鉴定样本的特征吸收峰。
吸光度扫描模式应用广泛，常见于无标记蛋白含量测定（如BCA、Bradford）、化学发色底物检测（如TMB、PNPP）等场景。硬件层面需配备可变波长滤光片或单色仪，高端配备光栅+反射镜实现精准波长切换。
2.2 荧光（Fluorescence）扫描
荧光检测利用激发光照射样本后，样本中荧光分子发射出波长较长的光，通过滤光片或单色仪分离不同波长信号后检测。荧光灵敏度远高于吸光度，适合微量或高灵敏实验。其扫描模式丰富，主要包括：
顶读荧光扫描（Top Read Fluorescence）：光路自上而下，激发光从板面进入，发射光由同侧收集。适合测量微孔板底部不透明或含有沉淀的样本，常见于细胞荧光测定、染料偏析测量等。
底读荧光扫描（Bottom Read Fluorescence）：光路自板底发射，激发光穿过微孔板底部进入样品，发射光由底部探测器接收。适合测量无色透明、底部无遮挡的孔板，典型应用于细胞活性测定（如Resazurin或荧光蛋白荧光强度）、核酸定量等。
全波长荧光光谱扫描（Fluorescence Spectral Scan）：可连续改变激发波长或发射波长，对荧光强度进行多通道扫描，获得完整的激发-发射矩阵（EEM），便于多重染料区分、多色实验或荧光染料库筛选。
时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence, TRF）：基于稀土螯合物（如Eu^3+、Tb^3+）荧光衰减时间较长的特性，激发后延迟一定时间（如50-100 微秒）再采集发射信号，极大地降低背景荧光干扰。多用于荧光免疫检测（TRF-ELISA）与端点分析。扫描时仪器会在每个孔先发射激发脉冲，随后在预定延迟后采样并测量发射强度。
荧光共振能量转移（FRET）扫描：适用于研究分子间相互作用。仪器需要配备两个或更多对的激发/发射滤光片组合，在一个孔内依次或同时激发供体荧光，同时采集受体荧光信号，通过计算受体/供体强度比值获得能量转移效率。部分高端设备可对FRET信号进行全波长扫描，以优化能量传递对。
荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）扫描：基于荧光分子的旋转扩散速率与分子质量相关，仪器设置偏振激发光与偏振检测器，测量不同偏振方向下的荧光强度差，通过计算偏振度可获得分子结合情况。扫描流程为：依次对每个孔给予偏振激发，记录平行与垂直方向发射强度，计算偏振值。
荧光扫描模式具有灵敏度高、线性范围宽、可进行多重检测等优势，但对于滤光片或单色仪的选择要求高，试剂选择及板型（如黑色底板）也需匹配，否则易出现串色、散射或反射干扰。
2.3 发光（Luminescence）扫描
发光检测无需外部激发光，直接测量样本中荧光底物或化学发光反应产生的光。其优点是背景低、灵敏度极高。主要扫描形式包括：
常规化学发光（Chemiluminescence, CL）扫描：底物在酶（如辣根过氧化物酶）催化下产生化学发光，通过光电倍增管（PMT）或CCD相机进行检测。扫描流程一般是端点测定，给定孵育时间后对整板或逐孔捕捉发光强度。
生物发光（Bioluminescence）扫描：例如荧火虫萤光素酶与荧光素反应产生发光。可实时或端点扫描。部分仪器具备快速扫描模式，可按设定时间间隔对整板进行多次测量，适合动力学曲线绘制。
荧光-发光复合扫描（Fluorescence & Luminescence）：高端酶标仪多通道检测系统可以在一个实验中依次进行荧光激发/发射扫描与发光信号采集，灵活切换检测模式，便于复杂实验设计。
发光扫描对仪器暗室要求严格，需要消除环境光干扰，部分设备在板仓周围设置高效隔光罩或光屏，通过单片机控制延迟测量以确保准确性。
三、基于操作流程的测定策略
3.1 端点测定（End-Point Measurement）
端点测定是最简便的扫描方式，即在反应达到稳定终点后，对每个孔在预设波长/模式下进行一次性采样。其典型应用在：
颜色显色底物（如TMB、OPD）完全显色后进行一次读取
发光底物（如Luminol）在峰值时间点进行拍光
荧光底物在反应末期测量稳定荧光信号
端点测定通常在方法开发时确定最佳终点时间，以保证测量信号稳定且线性范围合适。扫描时序简单，对仪器占用时间较短，适合高通量终点筛选实验。
3.2 动力学测定（Kinetic Measurement）
动力学测定强调在反应进行过程中对同一孔进行多次连续采样，从而绘制随时间变化的酶促反应曲线，可用于酶动力学研究、实时活性监测、底物消耗速度测定等。扫描策略包括：
固定波长多次扫描：在某一确定的波长下，以秒级或分钟级间隔反复读取，得到一条随时间变化的吸光度/荧光/发光曲线。
多波长梯度扫描：在每次读取中同时获取两个或多个预先设定波长的信号，以分析基线漂移、底物副产物变化等。
全谱动力学扫描：较少用于常规模式，因为会大幅延长测定时间。一些高端系统可在动力学过程中对部分关键波段进行频段扫描，如340 nm、405 nm、450 nm分时段扫描。
动力学模式下，仪器需具备精确自动移板功能以及高速调节滤光片或单色仪读入不同波长的能力。同时，通过软件可自动计算初速度（V_0）、米氏常数（K_m）等动力学参数。
3.3 斜率测定（Slope Measurement）
斜率测定介于端点与动力学之间，通常只在反应初期或中期选取几个时间点（如0、1、2、3分钟）进行快速读数，通过拟合线性部分曲线计算斜率。其优点是相比全程动力学扫描减少了检测次数，同时比单点端点测定更能反映反应速率。常用于：
酶活性筛选：选取初始速率区间进行斜率计算，可快速区分高活与低活样本。
检测试剂批次稳定性：在工艺检测中，通过斜率变化监测试剂活性衰减情况。
实现方式是预先在软件中设定测量间隔与时间点，仪器在对应时间点自动读数并存储数据，最后输出斜率及相关统计参数。
3.4 多点相对测定（Dual/Multi-Wavelength）
多点相对测定常见于需要背景校正或多成分同时测量的场合。主要方式包含：
双波长测定（Dual Wavelength Measurement）：典型如在目标吸收峰（如450 nm）与参比波长（如620 nm）处各测一次，并用目标减去参比吸光度以校正基线漂移。
多波长扫描（Multi-Wavelength Scan）：同时获取若干预设波长处的数据，以用于多重指标检测（如同时测定总蛋白及核酸含量），也可用于判断甲醛、酮体测试等化学试剂多吸收峰分析。
斑点模式（Spot Scan）：部分仪器支持在同一个孔内选取多个不同位置（中心、边缘等）进行光强采集，以评估液体分布均匀度或孔底成膜状况。
多点相对测定可以显著降低假信号风险，提高定量精度，但在操作上需保证滤光片切换或单色仪平移的及时性，否则会影响时间同步性。
3.5 全孔/区域扫描（Well/Plate Scanning）
某些高灵敏度或特殊应用需对孔内进行网格化扫描，如用于：
细胞成像（Cell Monolayer Imaging）：在荧光检测模式下，将一个孔分成若干小格，对每一小格依次激发与采集，以获取孔内细胞分布、形态及荧光强度分布图像。
聚焦定位（Focal Scan）：针对荧光寿命或显微检测，可在孔深度方向多层次扫描，收集不同焦深层图像，用于三维重建或细胞内结构分析。
光散射检测（Turbidity/Scatter Scan）：在酶促动化学反应产生沉淀或聚合物时，通过跨孔径扫描可捕获光散射信号，适合检测蛋白聚集、纳米粒子聚合等过程。
区域扫描模式对仪器运动系统、软件控制和数据存储要求极高，需要高精度XYZ三轴控制平台与高速数据采集通道，通常仅见于科研级或成像型酶标仪。
3.6 温度梯度扫描与热依赖测定（Temperature Scan）
部分酶标仪支持内置温控模块，可对微孔板进行升温或降温，同时在不同温度下获取检测信号曲线。常见于：
酶活性温度依赖分析：通过在37°C、45°C、55°C等多个温度点进行端点或动力学测定，得出酶在不同温度下的活性变化曲线，推算最适反应温度。
核酸熔解温度测定（Tm）：在实时PCR或荧光熔解曲线实验中，通过温度梯度扫描配合SYBR Green荧光信号，绘制熔解曲线并计算Tm值。部分多功能平台集成了荧光检测与温控模块，可实现简单的实时PCR及熔解分析。
温度梯度扫描要求仪器具备快速且均匀的温度控制能力，以及温度与信号测量的同步采集模块。
四、基于光路取样方向与配套功能
4.1 顶读（Top Read）与底读（Bottom Read）
光路方向是扫描模式的重要维度之一，决定了适用的孔板类型与实验对象。
顶读（Top Read）：激发光从板面上方照射至样本，发射/透过光亦从上方被探测器捕获。适用于以下场景：
黑色/暗色底板或不透明底板的荧光实验，可避免底部反射干扰。
样本上方浮游细胞或沉淀物较多时，可直接照射液面。
发光实验一般优先使用顶读模式，因为无需穿过孔板底部即可采集光。
底读（Bottom Read）：激发光从板底进入样本，发射光也从底部探测。适用于：
透明塑料或玻璃底板细胞培养实验，例如荧光蛋白表达检测、细胞活性测定，因细胞贴壁生长在底部，底读信号更优。
微孔板底部凸起或凹入结构（如黑色圆底板），需要减少散射与反射时。
时间分辨荧光与FRET实验，为保证探测效率，常选底读模式。
部分高端仪器可同时支持顶读与底读，并在软件中设定为优先使用底读，当底板检测失败或样本不透明时自动切换为顶读。
4.2 光路聚焦与孔位定位
除了光路方向，不同仪器在聚焦方式与定位精度方面也各不相同：
固定焦点模式（Fixed Focus）：在研制时确定好光源与探测器之间的距离，以一个焦点距离扫描所有孔，适合孔深相同、液面高度一致的标准微孔板。优点是速度快，硬件结构简单。缺点是一旦板型或试剂体积不同，可能导致信号衰减或偏差。
自动聚焦模式（Auto Focus）：在每个孔测量前，仪器会先进行快速预扫描，调整焦距以保证探测准确。适用于多种板型或较复杂底层结构的样本，但会牺牲一定的扫描速度。
多区域对焦模式：在一个孔内选取多个焦点层面进行光强采集，最终综合计算最佳信号。常见于三维成像或细胞分层检测。
不同焦距控制策略会直接影响检测灵敏度与重复性。科研实验中需根据试剂体系与板型选择合理方案。
4.3 搅拌与恒温配套功能
对于动力学测定和发光实验，部分仪器还集成了平台搅拌与恒温功能，扫描模式往往与这些配套功能紧密配合：
可编程温控模块：提供4°C ~ 45°C 或更宽温度范围，可在读数前后或读数间隔中保持板温恒定，避免温度漂移对酶活性及荧光效率的影响。
震荡/搅拌功能：在动力学测定时可启动板面轻微振荡，以确保液体混合均匀。扫描策略中可设定在激发前或激发后进行短暂搅拌，减少分层不均对信号的影响。
光屏蔽与暗室模式：对于发光实验，设备通常具备全自动光屏蔽系统：在采集过程中自动关闭室内光源或启用专用隔光罩，以保证发光信号的纯净度。扫描软件会在发光测定开始前先检查暗室环境是否达到要求。
五、未来发展趋势与注意事项
5.1 未来扫描模式创新方向
人工智能辅助扫描：基于深度学习算法对荧光/吸光谱进行自动质控、峰值识别及异常数据剔除。
多模态集成检测：在同一次扫描中同时采集吸光度、荧光、发光甚至散射光等多种信号，实现“一机多用”，满足复杂实验需求。
微光子学与纳米技术结合：通过纳米结构板底与超灵敏探测器，提高小体积样本的信噪比，从而实现单细胞或超痕量检测。
在线自动化高通量平台：与机器人臂、自动化液体处理模块深度集成，可实现无人值守的全自动化长周期实验，包括实时动力学监测、自动采样与数据上传。
云端数据分析与远程控制：配合物联网技术，将扫描数据实时传输至云端分析平台，支持远程监控与多实验室数据共享。
5.2 选择合适扫描模式的注意事项
实验目的与检测灵敏度：若仅需常规定量，端点吸光度/荧光模式已可满足；若需高灵敏或动力学分析，应选择相应的动力学扫描、多点扫描或时间分辨模式。
孔板类型匹配：根据是否使用黑色、透明、白色底板，或圆底、平底板，选择顶读或底读模式。若板型为透明底板且样本无强浑浊，可优先考虑底读荧光，以提高信噪比。
仪器硬件限制：部分仪器不支持全波长扫描或自动聚焦，若实验需全谱数据支持，则需选用具备单色仪或可调滤光片的高端机型。
数据处理能力：全波长或区域扫描会产生海量数据，需考虑仪器自带软件及PC端计算能力，避免因数据量过大导致运算缓慢、存储压力大。
温控与搅拌需求：动力学测定中如对温度敏感，必须选配具有精确温控与可编程搅拌功能的型号；若仅做端点检测，可无温控要求。
试剂及实验耗时：化学发光往往峰值时间较短，仪器需具备快速扫描与自动延迟触发；而时间分辨荧光需要控制延迟时间与采集脉宽，因此要选用支持脉冲激发与微秒级别采集的设备。
5.3 常见误区与问题排查
选择错误波长导致假阴/假阳：常见于使用吸光度扫描时未做双波长校正，或荧光检测时没有排除自发荧光背景。
底读模式使用不当：若板底不透明或含有微量颗粒，底读可能无法采集到有效信号，应改用顶读模式。
动力学间隔设置不合理：过长的读数间隔可能无法捕捉快速反应初始速率，过短的间隔会导致仪器忙碌甚至漏读。
温度梯度不均导致数据波动：如果温控模块分区温度不一致，可能出现不同孔位之间信号差异，应定期校准温控板。
全波长扫描速度较慢：在高通量筛选中若对每孔进行200多个波长扫描，将极大延长实验时长，一般需在方法开发阶段选定有限波段再运行。
总结
酶标仪读板器的扫描模式形式多样，涵盖吸光度、荧光、发光、时间分辨荧光、荧光共振能量转移与荧光偏振等检测方式，也囊括端点、动力学、斜率、多波长、全光谱、温度梯度等测定策略，更细分为顶读与底读、区域扫描与单点扫描、自动聚焦与固定焦点等光路选择。掌握各种扫描模式的原理与适用场景，对实验设计与仪器选型至关重要。
