酶标仪LOD（检出限）和LOQ（定量限）如何计算

一、引言

随着生物医学与临床诊断对分析灵敏度提出越来越高的要求，酶联免疫吸附实验（ELISA）作为一种广泛应用于微量分析的定量方法，其检测性能评价变得尤为关键。其中，LOD（检出限）和LOQ（定量限）作为衡量检测方法灵敏度和定量能力的核心指标，已成为酶标仪法检验方法学验证、产品注册、药物研发及第三方检测中不可或缺的部分。本文将系统阐述LOD与LOQ的定义、统计计算方法、数据处理流程、酶标仪特性对其影响，以及实际操作中的应用策略。

二、基本概念与理论基础

2.1 LOD：检出限的定义

检出限（Limit of Detection, LOD）是指能可靠区分“空白样本”与“最低可检样本”之间的最小分析物浓度，即：

在给定置信度下，仪器或方法可检测但尚不能精确定量的最低浓度。

在ELISA中，LOD的存在意味着当样本浓度低于此值时，信号可能被背景噪声淹没，无法区分阳性与阴性。

2.2 LOQ：定量限的定义

定量限（Limit of Quantitation, LOQ）是指分析物浓度达到某一水平时，检测方法可在给定精度与准确度下进行可靠定量的最小浓度。

在保证精密度（如CV≤20%）和准确度（误差≤±20%）的条件下可实现定量的最低分析物含量。

2.3 区别与联系

三、LOD与LOQ的统计计算方法

3.1 基于空白样本的经典公式法

最常用的方式之一是以空白样本测定值的均值与标准差（SD）为基础，进行如下计算：

• LOD = 平均空白值 + 3 × SD

• LOQ = 平均空白值 + 10 × SD

示例操作：

设空白样本测得OD值为：

平均空白值 = 0.0447
SD = 0.0015

则：

• LOD = 0.0447 + 3 × 0.0015 = 0.0492

• LOQ = 0.0447 + 10 × 0.0015 = 0.0597

说明：当样品OD值高于0.0492时，可认为检测到分析物；当OD高于0.0597时，才具备稳定的定量依据。

3.2 回归线交点法（标准曲线外推法）

该方法适用于已知标准品浓度并拟合标准曲线的定量检测：

1. 绘制标准品浓度（x）与信号（y）的回归曲线；

2. 求出空白均值 ± N×SD 所对应的信号；

3. 代入回归方程反推对应的浓度，即为LOD或LOQ。

适合于双对数回归、四参数拟合、线性回归等标准曲线模型。

3.3 精密度法（变异系数法）

在实际实验中，常根据多个低浓度样本进行重复测定，并以变异系数CV为标准：

• 找出最低浓度使得CV ≤ 20%，定义为LOQ；

• LOD可取低于LOQ的一个浓度水平，或使用3×SD法计算。

该方法更真实反映仪器及试剂系统整体性能。

四、实验设计与样本布设原则

4.1 空白孔设置

• 至少设置6个空白孔以确保统计意义；

• 均匀分布于板面，以排除边缘效应；

• 所用基质必须为完整反应体系，缺少目标分析物。

4.2 标准品浓度分布建议

• LOD与LOQ重点关注低浓度区间；

• 建议设置0.1×、0.2×、0.5×LOQ推测值等超低浓度点；

• 每点设3~6个重复，获取CV值与回归残差。

4.3 标准曲线拟合注意事项

• 应选择拟合效果良好的数学模型，如四参数/五参数Logistic；

• R²≥0.990；

• 低浓度区不得出现“塌陷”或“平台效应”。

五、酶标仪系统特性对LOD/LOQ的影响

5.1 光学系统灵敏度

• 光源（如LED）波动幅度越小，背景越低，LOD越小；

• 检测器（如PMT或光电二极管）灵敏度越高，低信号识别能力越强。

5.2 滴定误差

• 微量加样器精准度影响空白与低浓度重复性；

• 建议采用自动加样平台，并定期校准。

5.3 板材背景吸附

• 低质量酶标板可能吸附底物或抗体产生非特异性信号，抬高LOD；

• 建议选择高结合力、低背景的品牌板材。

5.4 孵育条件与温控

• 孵育不均匀易导致孔间CV增大，影响LOQ判定；

• 控温误差 >±0.5℃ 会造成反应速率不一致，误判低浓度样本。

六、实际应用案例与计算示例

案例一：炎症因子IL-6的ELISA检测

实验室采用商业ELISA试剂盒测定IL-6，标准品浓度范围：0、1、2、5、10、20 pg/mL，使用回归方程：

$y=0.075\log (x)+0.03$

空白孔OD均值为0.033，SD = 0.0025

则：

• LOD信号 = 0.033 + 3×0.0025 = 0.0405

• LOQ信号 = 0.033 + 10×0.0025 = 0.058

代入方程得：

• LOD浓度 = 10^((0.0405-0.03)/0.075) ≈ 1.4 pg/mL

• LOQ浓度 = 10^((0.058-0.03)/0.075) ≈ 3.9 pg/mL

说明：该系统下IL-6最低检出为1.4 pg/mL，最低可稳定定量为3.9 pg/mL。

七、质量控制与验证策略

7.1 方法学验证要求

在药物注册、体外诊断试剂备案或第三方实验中，需提供：

• LOD/LOQ计算报告；

• 原始测定数据与统计分析；

• 精密度验证（CV）与准确度评估；

• 标准品溯源信息（国家标准物或国际参考品）。

7.2 异常情况处理

• 空白孔OD值波动过大：需排查污染或仪器漂移；

• 标准曲线拟合异常：尝试更换回归模型或排除异常点；

• LOD/LOQ不符合预期：重新设计低浓度标准梯度，扩大重复数量。

八、结语与展望

酶标仪检测系统中，LOD与LOQ不仅是反映系统灵敏度的核心指标，也是检验方法是否符合规范化要求的重要基准。通过科学设置实验条件、合理采集空白与低浓度数据，并结合回归模型分析和CV评估法，可准确计算与验证检出限与定量限。随着自动化仪器、AI数据处理与数字质控技术的发展，LOD/LOQ的计算将更为高效、可重复和标准化。未来，构建统一的LOD/LOQ计算模块与自动验证工具，将成为精准医学和高通量筛查平台的关键支撑之一。