一、前言与意义

酶标仪常用于ELISA、蛋白定量、荧光检测、发光检测等多种实验，具有操作简单、通量高、灵敏度强等优点。为了提升实验效率和数据一致性，许多实验室会根据不同实验类型或研究课题需求，自定义并保存相应的“实验方法模板”，以便在后续重复实验时快速调用，减少手动重复设置步骤。自定义模板不仅能提高测量精度，减少人为误差，还能实现实验参数的标准化管理，使实验流程可追溯、可复制。本文将从软件功能原理、操作流程、参数设计、模板管理与共享等多个维度展开说明，帮助读者全面了解如何构建并应用高效可靠的酶标仪实验方法模板。

二、自定义模板的需求与准备

1. 明确实验类型与目标

在创建模板之前，首先要对实验类型进行充分分析，例如：

• ELISA定量检测（酶标反应后测定450 nm比色值）：需关注孵育时间、摇床速度、波长设置、读数方式（单波长、双波长）、空白校正方式等；

• 蛋白浓度测定（BCA、Bradford法）：与ELISA类似，但可能需要多波长扫描（如562 nm、595 nm等）、标准曲线拟合方式（线性、四参数）；

• 荧光定量实验（GFP、SYBR Green等）：需要设置激发光源、发射波长、增益（Gain）值、振荡强度等；

• 发光检测（ATP发光、荧光化学发光）：需调整闪光模式、积分时间、PMT灵敏度等。

在明确实验目的后，列出所有可能影响测量结果的关键参数，包括微孔板类型（透明/黑色/白色）、孔板密度（96孔/384孔/1536孔）、样品体积、震荡模式、温度控制、光源模式（单色仪、滤光片）、检测模式（终点测量、动力学曲线、端点时间间隔）等。对各实验类型的共性与差异有清晰认识，才能在模板设计时做到既简洁又全面。

2. 软件与硬件准备

不同厂商和型号的酶标仪配套软件界面和功能存在差异，但一般都具备以下模块：

• 实验设置界面：用于指定板型（96孔、384孔等）、波长、检测模式等；

• 孔位参数设置：可为每个孔位或孔组分配样品类型（标准、对照、样本）以及微孔板布局；

• 标准曲线/样本排布：支持手动指定标准品浓度和位置，也可自动递增或递减浓度；

• 读取模式：包括终点测量（Endpoint）、动力学曲线（Kinetic）、多波长扫描（Spectral Scan）、荧光强度（Fluorescence Intensity）等；

• 数据计算与分析：如标准曲线拟合（线性、非线性4PL或5PL）、空白校正方式、背景扣除等；

• 模板管理：新建、保存、编辑、删除、导出、导入、自定义命名等功能。

在开始创建模板前，请确保：

1. 酶标仪硬件正常校准：保证光源、检测器、温控模块运行正常，避免由于硬件漂移导致模板参数无法复用。

2. 软件版本与授权：确认配套软件已安装并激活，且版本为最新推荐版本，以支持更多功能及BUG修复。

3. 实验所需试剂和耗材准备就绪：包括微孔板、标准品、试剂缓冲液等，使演示操作与实际实验场景保持一致。

三、模板创建的总体流程

一个完整的模板创建流程通常包含以下五个阶段：

1. 选择实验类型：在软件“新建实验”或“新建方法”对话框中，先选择最接近实际需求的预设实验模式，如“ELISA-单波长比色”、“荧光定量-端点模式”等，以便获得初始配置。

2. 定义孔板布局：在图形化的微孔板界面，将标准品孔、对照孔、样品孔、空白孔等进行“拖拽”或“点击”标记，若有重复样本或复孔要求，可批量选中孔位批量复制粘贴标签。

3. 设置检测参数：根据实验需求设置波长（单波长或双波长）、读取方式（终点／动力学）、震荡模式（无震荡、线性震荡、环形震荡）、积分时间（仅发光检测）、增益值（仅荧光／发光检测可调）等。

4. 配置数据处理方式：如启用或关闭空白孔扣除、选择标准曲线拟合模型、设定拟合系数下限（如R²≥0.99）、启用自动标记失控孔（CV值超限报警）等。

5. 保存并命名模板：将上述设置保存为“.mth”或“.xml”格式，并给予有实际意义的名称，比如“ELISA_450nm_4PL_202506”，以便后续快速调用和版本管理。

下面将依次展开每个阶段的具体操作要点。

四、选择实验类型与初始模板

1. 启动软件并选择“新建方法”

打开酶标仪配套软件后，常见主界面左上方会有“File（文件）→New Method（新建方法）”或“Method List（方法列表）→New（新建）”按钮。点击后，弹出“选择实验类型”对话框。常见选项包括：

• Endpoint OD（终点比色）

• Kinetic OD（动态比色）

• Spectral Scan（多波长扫描）

• Fluorescence Intensity（荧光强度）

• Luminescence（发光）

• Dual Read（双模式读）

根据实验需求，一般选择“Endpoint OD”或“Kinetic OD”作为起点。若后续需多波长相关分析，可选择Spectral Scan并在参数中设定扫描范围；若检测荧光或发光，则选择相应模式。点击“OK”后，软件会自动加载对应模块的默认参数和模板布局。

2. 利用厂商预置模板或空白模板

很多酶标仪软件自带若干预置模板，如针对常见的ELISA试剂盒（例如：IL-6、TNF-α等）的模板，已经预先将96孔板的标准曲线位置、对照孔和样本孔位置全部标注好，只需修改标准品浓度即可。若实验类型较为常规，可直接选择合适预置模板，省时省力。但若实验具有特殊需求，如自制试剂盒或非标品检测，就需要从“空白模板”或“自定义模板”选项开始，逐步完善孔板布局与参数设置。

五、孔板布局与样本排布

1. 孔板类型与孔板规格

首先在顶端工具栏或“Plate Setup（板型设置）”对话框中选择微孔板类型。常见规格包括：

• 96孔（Standard Flat-Bottom）

• 96孔（Half Area）

• 384孔（Standard）

• 1536孔（High Density）

不同孔板直径与孔壁厚度不同，会影响光路聚焦和检测灵敏度。若检测荧光或发光，通常选用黑色/白色荧光/发光专用板；若检测OD值，则使用透明平底板。确认孔板类型后，软件会在界面中绘制对应孔位示意图，方便后续标注。

2. 标记标准品、对照与样本孔

在图形化孔位界面，将光标移动到目标孔位，点击右键或选择“Assign（分配）”，将该孔位标记为“Standard（标准品）”、“Control（对照）”、“Sample（样本）”或者“Blank（空白）”。可按以下思路进行排布：

• 标准品（Standard）：常规将标准品做成二倍梯度稀释，如8个不同浓度点，可在一列或一行连续排布，也可分散于边缘位置以减少边缘效应。建议至少做两列平行重复，以保证标准曲线稳定性；

• 阴性/阳性对照（Negative/Positive Control）：放置于标准品两侧或板的对角线位置，以便判定实验批次质量；

• 样本（Sample）：可按照实验分组分区，使用不同颜色或标记区分不同处理组。若样本数量较多，软件通常支持“拖拽”选中多个孔位一次性标记；

• 空白孔（Blank）：用于扣除底板背景值，可将若干孔均匀分布在板内（如四个角或中心四孔），减少液面高度差异带来的误差。

在标记时要注意区分“行列式分组法”（例如：A1–A8为标准品梯度、B1–B3为对照、B4–B12为样本）或“交错式分组法”（将相邻几孔作为单位梯度），根据实验需求灵活设置。完成标记后，软件通常会在孔位上以不同颜色或符号显示样本类型。

3. 孔位标签与批注

为了在后续调用时快速识别某个孔位对应的样本编号，建议在标记好孔位后，利用软件的“Notes（批注）”或“Sample ID（样本编号）”功能，将样本名称、编号或批号直接填写到对应孔位信息栏。这样在测量后导出的报告中，会直接显示样本ID，减少与手工记录对应的工作量。批注内容也可包含“稀释倍数”“处理浓度”等关键信息，便于后续复盘。

六、检测参数精细设置

在完成孔板布局后，进入“Detection Settings（检测设置）”对话框，主要对下面几个方面进行自定义：

1. 波长与光路模式

• 单波长（Single Wavelength）：用于大多数ELISA终点检测，常见波长为450 nm（常规比色）或570 nm/630 nm（二次校正）。在设置中选择“Primary Wavelength（主波长）”并输入数值；若软件支持双波长校正，可启用“Secondary Wavelength（次波长）”，填写（如630 nm）以扣除底物漂移和光干扰。

• 多波长扫描（Spectral Scan）：适用于需要光谱信息的应用，可设定扫描范围（如400–700 nm）和步长（如1 nm或2 nm）。扫描模式会显著增加检测时长，一般只在仪器空闲或对某些未知样品进行吸收光谱分析时使用。

• 荧光检测（Fluorescence）：需要设置激发波长（Ex）和发射波长（Em），并指定滤光片类型或单色仪模式；同时可调整PMT增益（Gain）或探测器电压，使信号在合适的动态范围内。

• 发光检测（Luminescence）：无需指定波长，但需设定“积分时间（Integration Time）”和“闪光模式（Flash Mode）”，如“延迟时间（Delay）”和“积分时间（Integration）”参数决定检测灵敏度和信噪比。

2. 读取模式与顺序

• 终点测量（Endpoint）：最常用模式，仪器加样后二次孵育结束后同时读取所有孔的吸光度或荧光强度。可选择是否先摇匀、震荡方式（线性、椭圆、循环）和震荡时间（如30 秒）。

• 动力学曲线（Kinetic）：用于测定反应速率，通过多次连续读数获得光吸收值随时间变化的数据。需要设定“周期数（Number of Reads）”、“读数间隔（Interval）”和“单次读数延迟（Lag Time）”等参数。例如：读取10 次，每隔30 秒读取一次，延迟5 秒后开始。

• 端点定时读取（Fixed Time）：与终点类似，但可在孵育特定时间后自动启动读数，例如在加底物后设置“孵育300秒→开始读数”，可避免人工定时误差。

• 荧光/发光多通道（Multiple Reads）：对同一孔重复多次读数，以提高信噪比或检测低浓度信号，可设置“重复次数（Replicates）”和“读取间隔（Interval）”。

3. 震荡与加样顺序

• 震荡模式：一些酶标仪支持“线性震荡（Linear）”、“环形震荡（Orbital）”、“双模式震荡（Dual-Mode）”等。不同模式对不同实验有影响，ELISA常用低速震荡（300 rpm）以促进样品与固相抗原/抗体结合；荧光检测可能不需震荡，直接读取即可。

• 加样顺序与预热：对于动力学或发光实验，推荐先预热微孔板（若仪器支持恒温台）或者在开始读数前设置“预热10 分钟”，使温度稳定。若加入酶底物后立即读取，可避免温度漂移引起信号波动。

4. 标准曲线拟合与校正

• 拟合模型选择：常见ELISA标准曲线拟合模型包括“线性回归（Linear Fit）”、“对数回归（Logarithmic Fit）”、“四参数曲线（4-PL）”、“五参数曲线（5-PL）”。若标准品点数较多且跨度较大，推荐使用4-PL或5-PL模型，提高拟合准确性；若浓度范围较窄且变化线性明显，可使用线性模型简化计算。

• 空白校正方式：可勾选“减去空白孔平均值（Subtract Blank）”或“扣除零点（Zeroing）”，确保各孔最终数值已扣除背景。若使用双波长校正，则输入次波长并启用“双波长校正（Dual Wavelength Correction）”，将主波长减去次波长信号，实现内源色素或底物漂移补偿。

• 拟合参数约束：有些软件允许用户设置拟合约束，如“上下限（Lower/Upper Limits）”、“R²>0.995”作为判定标准。若拟合不符合要求，软件会自动警示，并可手动剔除某些异常点重新拟合。

5. 数据输出与报告样式

• 报表字段选择：在“Report Settings（报告设置）”中，可选择是否包含“原始OD值（Raw OD）”、“计算浓度值（Calculated Concentration）”、“标准曲线方程（Curve Equation）”、“拟合R²值（R²）”、“质量控制指标（QC Metrics）”等字段。有些实验室只需最终浓度结果，可隐藏原始值以简化报告；但出于可追溯性考虑，建议同时保留原始值字段并导出CSV或XLSX格式。

• 图表格式：可勾选“附带标准曲线图（Include Standard Curve Graph）”、“样本分组柱状图（Sample Group Bar Chart）”等选项，将图表直接嵌入报告。有时候需要将报告直接邮寄或归档，生成PDF格式较为方便；若需要后续在Excel中编辑，可导出XLSX或CSV+PNG图表两部分文件。

• 文件命名规范：在模板中填写统一命名规则的占位符（Placeholder），如{Date}_{InstrumentID}_{MethodName}_{BatchID}，软件在运行完成后会自动替换为实际值，可有效避免人工输入错误。

七、保存模板与调用管理

1. 模板保存流程

在所有参数设置完成后，点击软件主界面上的“Save Method（保存方法）”或“Save As（另存为）”按钮，在弹出的对话框中填写模板名称与描述。例如：

• Template Name（模板名称）：ELISA_450nm_4PL_常温震荡

• Description（描述）：适用于实验室IL-6 ELISA试剂盒，450 nm比色检测，4PL拟合，常温震荡300 rpm 3 分钟。

保存时通常会要求选择保存路径，默认路径一般为软件安装目录下的“Methods”或“Templates”文件夹。实验室可将此路径映射至网络共享盘，便于多台仪器或多名操作人员统一调用。

2. 模板调用与编辑

当需要执行新实验时，通过“Method List（方法列表）”查看已保存模板，或在“Open Method（打开方法）”列表中双击所需模板，即可加载所有参数与孔板布局。若实验条件发生变化，如更换试剂批号、孔板类型或波长，需先“Save As”另存为新模板，并修改相应字段，确保原始模板不会被覆盖。

编辑模板时，可打开已保存模板后点击“Edit Method（编辑方法）”，对任何参数进行修改。建议将版本号或修改日期写入“Description”或“Method Name”中，维持良好版本控制。例如：

• 原模板：ELISA_IL6_450_4PL_v1；

• 修改后：ELISA_IL6_450_4PL_v2_202506。

3. 导入与导出功能

许多酶标仪软件支持将模板以单个文件或压缩包形式导出（Export），并通过“Import Method（导入方法）”功能在其他计算机或仪器上加载模板。实验室在更换仪器或扩展检测台时，可将旧仪器上的所有自定义模板导出并导入到新仪器，保证各实验室仪器之间参数一致。

此外，也可将模板导出为XML或CSV格式，以文本形式在版本管理系统（如Git）中进行备份，方便追踪修改记录与实现多人协作。

八、模板分发与权限管理

1. 模板共享策略

• 集中部署在网络共享盘：在局域网上建立一个“酶标仪模板库”文件夹，将所有已审核的模板放入，按照项目或实验类型分类子文件夹。各仪器所连计算机可映射该共享盘，并在软件设置中指定“加载模板目录”，实现快速调用。

• 只读与可写权限区分：为了保证核心模板不被误改，建议将“Approved（已审核）”目录设置为只读权限；若有新模板开发需求，可在“Draft（草稿）”目录下创建并测试，新模板通过验证后，再移动至“Approved”目录。

• 定期审查与归档：每季度或每半年由实验室质量主管对模板进行审查，对不再使用或不符合最新实验规范的模板进行归档或删除，避免模板库堆积过多冗余文件。

2. 用户权限与操作日志

• 分级权限：实验室可将操作人员分为“模板管理员”、“普通用户”两类。管理员拥有“创建/编辑/删除/导入/导出”完整权限；普通用户仅能“调用/使用”现有模板，若需创建新模板需要提交给管理员审核。

• 操作日志：如果软件自身不支持日志记录，可借助网络共享盘的操作审计功能或企业级存储设备的审计模块，记录各用户对模板文件的“访问时间”、“修改时间”、“删除操作”等。定期导出日志并归档，以便日后追溯。

九、常见问题与优化建议

1. 参数设置深度与简化

有时为了保证数据精准，软件中会出现大量可选参数（如震荡模式选择、高级滤光片校正、温度分段控温等），盲目开启全部参数反而增加学习成本与出错风险。建议：

• 先从核心参数入手：如波长、读数模式、孔位布局、标准曲线模型、空白校正等；

• 按需开启高级功能：如对关键实验可启用温度控制、振荡周期调节等；对常规ELISA可先关闭多余选项；

• 分步验证：先创建一个简化模板，在小规模检测后确认数据稳定，再添加复杂参数。

2. 不同仪器之间的差异

同一品牌不同型号的酶标仪在软件界面、支持的波长范围、读数精度、控制功能等方面可能存在差异。若实验室同时拥有多台不同型号设备，应注意：

• 尽量使用同一型号进行同一项目实验，避免跨型号比对压力；

• 针对不同型号分别创建对应模板，坚持“条件等同性”原则，即参数尽量保持一致，波长、波长带宽、震荡强度等细节要进行校准；

• 在报告中注明仪器型号与序列号，确保结果可追溯。

3. 标准曲线与质控指标监控

多次使用同一模板进行实验时，需定期监控标准曲线质量，避免长期使用导致拟合精度下降。建议：

• 定期绘制标准曲线对比图：记录每次拟合的R²值、斜率、拦截值等关键参数，并绘制随时间变化曲线；若发现拟合参数偏离设定阈值，应重新制备标准品溶液或校准仪器。

• 设置质控控制图（QC Chart）：对空白孔、对照孔OD值或荧光值绘制控制图，观察批次间漂移；若数据连续超出控制上下限，需排查试剂批次、微孔板一致性和仪器状态。

• 批次标签与耗材追踪：在模板或批注中加入“微孔板批号”“底物试剂批号”等信息，以便在发生质量偏差时快速定位问题来源。

4. 模板的持续优化

随着实验需求的变化和新技术的引入，原有模板可能无法满足新项目要求，需要不断优化。建议：

1. 收集用户反馈：在使用模板时，让操作人员记录在使用过程中遇到的问题或改进建议，汇总后由管理员评估可行性;

2. 小规模试验验证：不要直接在大规模正式实验中修改模板，只在小样本或模拟板上验证修改参数的效果;

3. 版本管理与备份：每次优化后，新模板都应另存为新版本，并做好旧版本的备份，以便在新模板出现问题时能够迅速切换回旧版本；

4. 定期培训：组织实验室内部培训，分享最新优化的模板使用心得，让每位操作人员都熟悉参数变动原因和效果。