一、引言

酶标仪广泛应用于生命科学研究和临床诊断中，常见检测项目包括细胞因子、激素、卡介苗滴度、病原微生物抗体水平等。样品在检测前往往需要进行适当稀释，以保证检测信号落在仪器线性范围内，降低或消除样本基质中的干扰因子，从而提高检测灵敏度和准确性。稀释液不仅承担降低样品浓度的功能，还承担稳定目标分子、减少非特异结合、平衡等温状态和维持最佳pH环境等作用。稀释液配方不当，可能导致信号偏高或偏低、曲线倾斜、重复性差等问题，严重时还会导致实验结果无法解释。因此，科学合理地选择和优化稀释液是保证酶标仪实验成功的关键环节。

二、样品稀释液的基本作用

1. 调整浓度
   样品往往含有高浓度或低浓度的目标分子，通过稀释液将其浓度调整至检出范围，避免饱和或信号过弱引发假阴或假阳。

2. 降低基质干扰
   血清、血浆、细胞培养上清等复杂基质中含有脂类、蛋白、多肽、盐类以及内源性酶等，可能与检测抗体或底物发生非特异性结合或者产生背景信号。适当稀释可稀释干扰物质浓度，同时稀释液成分（如蛋白、表面活性剂）可与这些干扰物相互竞争，从而减少基质效应。

3. 保持目标分子稳定性
   某些蛋白或抗体在非最适条件下易降解、失活或吸附于管壁。稀释液中常添加一定浓度的载体蛋白（如牛血清白蛋白、明胶）或防腐剂，能够提高目标分子稳定性、减少吸附损失。

4. 促进反应均一性
   稀释液成分应保证与标准品、对照品基质、稀释剂一致，以便样本与标准曲线具有相同的基质背景，提高定量结果的可比性。

5. 维持最佳pH和离子强度
   检测抗体与抗原之间的结合受pH和离子强度影响。稀释液通常采用缓冲体系（如PBS、TBS）维持中性或弱碱性环境，保证抗体-抗原反应效率。

三、常见稀释液类型及其配方

3.1 磷酸盐缓冲盐水（PBS，Phosphate Buffered Saline）

• 组成（常见配方）

• NaCl：137 mM

• KCl：2.7 mM

• Na₂HPO₄：10 mM

• KH₂PO₄：1.8 mM

• pH 调节至7.2–7.4

• 特性与应用
  PBS具有良好的生物相容性，接近生理渗透压与离子强度，不含蛋白质和表面活性剂，本身白底无荧光背景，适用于大多数ELISA或IHC免疫实验中作为稀释基质。若样本为细胞裂解液或尿液等简单基质，可直接使用PBS稀释。在PBS基础上添加牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉或Tween-20后，可进一步降低背景噪声，减少非特异性结合。

3.2 特比缓冲盐水（TBS，Tris-Buffered Saline）

• 组成（常见配方）

• Tris：20–50 mM

• NaCl：150 mM

• pH 调节至7.4–8.0

• 特性与应用
  TBS相对PBS对某些酶（如ALP，碱性磷酸酶）活性影响较小，并且在pH 7.4–8.0区间能够保持活性，往往用于双抗体或荧光底物体系中。此外，TBS中添加0.05%–0.1% Tween-20（TBST）作为洗涤或稀释液常用于减少膜实验（WB、dot blot）和ELISA中的非特异性信号。

3.3 含载体蛋白稀释液

• 常见载体蛋白

• 牛血清白蛋白（BSA）0.1%–5%

• 明胶（Gelatin）0.1%–1%

• 非脂乳粉（Non-fat Dry Milk）1%–5%

• 配方示例

• PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20

• TBS + 3% 非脂乳粉 + 0.1% Tween-20

• 特性与应用
  载体蛋白能够占据检测体系中非特异性结合位点，防止目标分子或抗体被吸附到塑料或固相载体上，还能在稀释过程中保护脆弱蛋白。对于血清或血浆样本，直接将其稀释到含有BSA或明胶的基质可以显著降低背景干扰。

3.4 蛋白质裂解及保存液

• 常见添加物

• 蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂混合物）

• 螯合剂（如EDTA）

• 缓冲组分（HEPES、Tris）

• 甘油（10%–50%）

• 配方示例

• 50 mM HEPES pH7.5 + 150 mM NaCl + 1 mM EDTA + 1% Triton X-100 + 10% 甘油 + 蛋白酶抑制剂

• 20 mM Tris pH7.4 + 137 mM NaCl + 2.7 mM KCl + 1 mM PMSF + 0.1% NP-40

• 特性与应用
  适用于细胞裂解液或组织匀浆后作为样本稀释基质，可抑制内源蛋白酶活性、保护检测指标稳定。此类稀释液不适用于直接血清或血浆样本稀释，否则会导致检测信号受裂解液本身成分影响。

3.5 实验室自制复合稀释液（矩阵匹配）

• 配方思路
  根据样本类型（血清、血浆、尿液、培养上清）和检测指标（激素、细胞因子、代谢物等），将样本基质中常见干扰成分（如脂质、盐类）通过有针对性的配方模拟，制作自制稀释液。例如，血浆稀释液可加入一定浓度的脂多糖、IgG、三酯等；尿液稀释液可加入尿素、肌酐、盐类等，以达到“基质匹配”。

• 特性与应用
  矩阵匹配稀释液能够使标准品与待测样本在相似干扰背景下进行比色或荧光检测，减少基质差异对定量曲线的影响。尤其在测定低丰度生物标志物（如胞外囊泡蛋白、外泌体标志物）时，若不采取矩阵匹配，会出现回收率低、线性范围变窄等问题。

3.6 商用预配稀释液/专用稀释液

• 常见品牌和类型

• 某品牌ELISA检测试剂盒配套稀释液（已优化pH、离子强度及载体蛋白浓度）

• 商业化标准化细胞因子稀释液（含有低抗体结合位点成分、稳定剂、抗菌剂）

• 动物标本专用稀释液（设计用于小鼠、兔子、灵长类血清或血浆稀释）

• 特性与应用
  商用预配稀释液通常经过厂家优化验证，配方保密并针对特定检测体系设计，使得用户无需自行摸索，提高重现性。但成本相对较高，且缺乏针对性基质匹配优势，并不适用于所有检测指标。

四、影响稀释液选择的关键因素

4.1 样本来源与基质特征

• 血清与血浆

• 血浆中含有抗凝剂（EDTA、肝素或柠檬酸盐）及纤维蛋白原等成分，若检测时加入含有多价金属离子的缓冲液（如含Ca²⁺、Mg²⁺），可能引发凝固反应。

• 血清基质较为稳定，但含有大量内源性IgG、补体蛋白与多种细胞因子，需在稀释液中适量加入载体蛋白与非特异结合阻断剂。

• 尿液与唾液

• 尿液相对清澈，但含有高浓度尿素、肌酐、电解质及色素物质，对某些酶底物或荧光检测可能产生抑制或淬灭。推荐使用低浓度尿素模拟水平（20–50 mM）及适当盐浓度（如50–100 mM NaCl）的稀释液。

• 唾液黏度高，含有黏蛋白和多种酶类（如淀粉酶），稀释液中可添加黏液溶解剂（如DNase、RNase抑制剂）以减少样本粘度对加样一致性影响。

• 细胞培养上清与组织匀浆

• 上清液含有培养基成分（胰岛素、生长因子）、血清蛋白及裂解产物，可能干扰检测。稀释液应稀释至培养基浓度以下（通常稀释10倍以上），并加蛋白酶抑制剂保护目标蛋白。

• 组织匀浆中含有大量细胞碎片、核酸与脂类，需要在稀释液或预处理步骤中进行高离速离心或过滤，减少颗粒杂质干扰。

4.2 检测指标物的理化性质

• 蛋白（抗原/抗体）

• 蛋白分子易受pH、温度、金属离子浓度以及表面吸附影响。稀释液常添加0.1%–1%非免疫性蛋白（BSA或明胶）以稳定蛋白结构并减少与微孔板塑料表面结合。

• 某些抗体在高盐环境中亲和力下降，稀释液中NaCl浓度一般控制在100–150 mM范围内。若目标蛋白易沉淀或易聚集，可在稀释液中加入0.01%–0.05% Tween-20以减少聚集。

• 小分子（代谢产物、激素、维生素等）

• 这类目标物通常比较稳定，但检测灵敏度受基质中酶或化学物质影响较大。稀释液中常含有抗氧化剂（如EDTA、抗坏血酸）防止氧化降解，并保证pH在缓冲区间（pH 7.0–8.0）。

• 对脂溶性物质（维生素A、D等），普通水性缓冲液溶解度低，可使用含少量DMSO（<1%）或乙醇（<0.5%）的稀释液，但需注意与酶标板和底物的相容性。

• 核酸（DNA/RNA）

• 实验中如需定量或定性检测核酸（如miRNA、mRNA），稀释液应含RNase或DNase抑制剂（如RNasin、DEPC处理的水）以防降解，并保持pH在7.5–8.0。

• 为减少核酸与塑料材料吸附，可在稀释液中添加0.01%–0.05% Tween-20或0.1% BSA。

4.3 检测方法与底物类型

• 酶联比色法（ELISA）

• 常用酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。对于HRP体系，稀释液中需避免含有抗氧化剂（如SDS、EDTA）等会抑制酶活的成分。最好选用PBS或TBS基础，并在表面活性剂（0.05%–0.1% Tween-20）与载体蛋白（BSA）浓度间进行平衡。

• ALP体系对金属离子（如Zn²⁺、Mg²⁺）敏感，稀释液可添加1–2 mM MgCl₂以保证酶活，同时避免高浓度的EDTA或重金属离子。pH控制在9.5附近（可使用碳酸盐缓冲）。

• 荧光检测

• 荧光底物常见衰减问题：某些基质中的酯酶、过氧化物酶会提前水解底物导致信号漂移，稀释液可添加特定抑制剂或使用预冷藏底物。

• 背景荧光：血清、血浆本身含有紫外可见荧光物质（如黄疸素、维生素），稀释时需降低样品浓度并在稀释液中加入0.1%–0.5% BSA或脱脂奶粉以吸附杂质。若检测短波长荧光（Ex<400 nm），稀释液中需使用低荧光背景的试剂，并避免使用含有荧光染料的可溶性蛋白。

• 化学发光（Chemiluminescence）

• 此类检测无需激发光源，但样品基质内的Peroxidases或过氧化氢酶污染可能导致底物自动发光。稀释液中可添加过氧化物酶抑制剂（如Sodium Azide 0.02%–0.05%）。若使用碱性磷酸酶标记体系，需保证无污染的离子环境（避免含有金属离子的缓冲液）。

五、稀释液选用策略及优化流程

5.1 确定稀释倍数

1. 预实验筛选

• 对未知浓度的样本，可先做系列倍数梯度稀释（如1:2、1:5、1:10、1:20、1:50），测定信号强度与背景噪声，以确定最佳检测线性范围。

• 若样本与标准品基质差异较大，需要在预实验中同时使用矩阵匹配稀释液进行对比，选出信号稳定、回收率接近100%的稀释倍数。

2. 参考文献或厂家说明

• 若使用商用试剂盒，厂家往往给出推荐稀释倍数范围，例如正常人血清稀释5–10倍，小鼠血清稀释20–50倍。可作为初步选择，然后结合预实验微调。

3. 定量曲线与样本稀释范围

• 根据目标分子在标准曲线上的浓度范围，计算实测样本浓度后推断稀释倍数，使最终读数位于标准曲线中心区域（信号强度在10%–90%之间最佳）。

5.2 选择稀释基质

1. 简单基质直接稀释（PBS/TBS）

• 若样本为基本无蛋白干扰、基础盐类一致（如纯化蛋白溶液）、细胞培养液等，可直接用PBS或TBS按倍数稀释。

• 若检测抗体-抗原体系，对离子强度要求较高，可优先选择TBS；对pH敏感需在pH 7.2–7.4范围内，则选PBS。

2. 添加载体蛋白进行阻断

• 样本为血清、血浆或含有多种蛋白质的混合物，当检测目标含量较低时，可在PBS/TBS中加入1%–3% BSA，以占据非特异性吸附位点，同时降低背景信号。

• 若BSA不能满足抑制需求，可改用脱脂奶粉（1%–5%）或明胶（0.1%–1%）。脱脂奶粉含乳糖蛋白及多肽成分，对多数抗体体系均适用；明胶分子量较大，对某些粘附力强的蛋白吸附效果更佳。

3. 添加表面活性剂减少非特异性结合

• 常用Tween-20（聚山梨酯-20）或Triton X-100（0.05%–0.1%）。表面活性剂能够破坏弱疏水结合，减少样本中某些疏水蛋白与微孔板表面结合导致的背景。

• 对于高灵敏度荧光检测，需注意Triton X-100本身存在荧光背景，优先使用Tween-20。

4. 矩阵匹配稀释

• 若标准品基质为缓冲液，而待测样本为血清、尿液等复杂基质，为消除基质差异引起的测量偏差，可使用“空白基质”（例如经过脱蛋白处理的健康人血浆）配制稀释液。

• 具体做法是将健康献血者血浆去除内源目标物（如蛋白A/G柱或硅胶脱色），之后将该脱蛋白血浆按一定比例（通常1:1或1:4）与PBS/BSA等混合，用于样本和标准品的稀释，使两者基质背景一致。

5. 保护目标分子稳定

• 对温度或pH敏感的蛋白，稀释液中可添加抗氧化剂（如1 mM DTT、5 mM EDTA）或稳定剂（如10% 甘油、0.02% NaN₃）。

• 核酸检测时加入RNase/DNase抑制剂；对于易沉淀蛋白，加入0.01%–0.05% Tween-20。

5.3 评估稀释液性能

1. 信噪比与背景测定

• 分别用稀释液空白、最低浓度标准品和最低浓度样本进行检测，计算信号/噪声比（S/N），优先选择背景低、S/N 高的配方。

2. 回收率实验

• 将已知浓度的纯化标准品或内标（Spike-in）加入不同稀释液基质中，比较加标前后检测值，以计算回收率。理想回收率在90%–110%之间。

3. 线性稀释验证

• 对同一样本进行不同倍数稀释（如1:2、1:4、1:8、1:16），绘制检测信号强度与稀释倍数的拟合曲线，判断线性关系（R²≥0.98）是否满足定量要求。若出现偏离，则需进一步优化稀释液成分。

4. 重复性与稳定性测试

• 同一批样品在同一稀释液配方中进行多次平行检测（至少3–5次），计算变异系数（CV），要求CV＜10%。

• 将稀释后样品在4°C保存数小时或室温保存30分钟后再次检测，评估目标物稳定性及稀释液保护效果。

5.4 具体案例示例

1. 血清IL-6定量（荧光ELISA）

• 样本：小鼠血清，IL-6待测浓度范围在1–100 pg/mL。

• 稀释液：PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20。

• 优化步骤：

1. 比较不同BSA浓度（0.1%、0.5%、1%、3%）对背景荧光的影响，最终确定1% BSA背景最低；

2. 对比含0.05%与0.1% Tween-20对非特异性结合的抑制效果，0.05%已足够；

3. 稀释倍数通过预实验确定为1:10。因此，最终配方为“1X PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20”，同一基础上将血清稀释10倍。

2. 人血浆肿瘤标志物PSA测定（比色ELISA）

• 样本：人外周静脉血浆，PSA浓度在0–50 ng/mL。

• 稀释液：TBS + 0.5% 谷氨酰胺 + 2 mM MgCl₂（若使用ALP标记）或TBS + 1% 牛血清白蛋白（若使用HRP标记）。

• 优化步骤：

1. TBS 缓冲体系保持pH在7.6–7.8，MgCl₂保证ALP活性；

2. BSA或谷氨酰胺混合使用以降低非特异结合；

3. 对比纯TBS与TBS+BSA稀释液对标准品和血浆样本的回收率，观察到TBS+BSA回收率从85%提升至95%以上；

4. 综合考虑酶活和非特异性结合，最终选定“TBS + 1% BSA + 2 mM MgCl₂”

3. 尿液肌酐测定（酶法比色）

• 样本：人尿液，肌酐浓度在0.1–5 mM。

• 稀释液：生理盐水（0.9% NaCl）+ 10 mM HEPES pH7.4 + 0.01% NaN₃（抑制尿液中细菌生长）。

• 优化步骤：

1. 对比不同盐浓度（0.1 M、0.15 M、0.2 M）对检测酶（肌酐脱氢酶）活性的影响，发现0.15 M NaCl最为适宜；

2. HEPES缓冲保证pH稳定，NaN₃抑制细菌，减少样本处理时间；

3. 最终稀释倍数定为1:20，保证检测值在比色谱线线性区间。

4. 细胞培养上清ECM蛋白定量（荧光PicoGreen法）

• 样本：细胞培养上清，待测DNA片段含量极低（1–100 ng/mL）。

• 稀释液：10 mM Tris-HCl pH8.0 + 1 mM EDTA + 10 μg/mL RNase + 0.01% Tween-20。

• 优化步骤：

1. Tris-EDTA体系保护DNA稳定并防止RNase干扰；

2. Tween-20减少上清中微量细胞碎片对荧光染料结合的竞争；

3. 通过标准曲线和上清稀释系列实验最终确定1:5稀释。

六、稀释液配制与保存注意事项

1. 配制步骤要点

• 称量和量取时要精确，缓冲盐溶解要完全，必要时用磁力搅拌并加热（不超过40°C）。

• pH 调节：一般先配制无蛋白缓冲液，调整pH 后再加入蛋白或其他添加剂，以免蛋白在异常pH下变性。

• 无菌操作：如果稀释液中含有蛋白或表面活性剂，需要保证无菌或在4°C下短期保存，长时间保存可采用0.22 μm 滤膜过滤后分装。

2. 过滤与灭菌

• 含有蛋白的稀释液易滋生细菌和霉菌，建议通过0.22 μm 滤膜过滤后分装于无菌容器中；如需长期保存，可在稀释液中加入0.02%–0.05% NaN₃（注意NaN₃对某些酶抑制）或0.01% 氯霉素作为抗菌剂。

• 若稀释液中含有易结晶盐类（如磷酸盐），应定期检查澄清度，发现混浊及时更换。

3. 保存条件

• 大多数稀释液可在4°C冰箱中保存1–2周；含蛋白稀释液不宜超过1周，若要长期保存，可冻存（–20°C），但含载体蛋白的稀释液反复冻融会导致蛋白变性，应分装为小体积。

• 对于含有酶抑制剂或金属螯合剂的稀释液，应根据抑制剂性质选择合适保存方式，如EDTA在室温条件下稳定，但PMSF等蛋白酶抑制剂需在–20°C条件下保存。

4. 稳定性评估

• 每次使用前检查稀释液是否出现沉淀或变色；

• 对关键实验，定期测试稀释液空白对底物或荧光染料的背景贡献，确保无异常信号。

七、常见问题及解决思路

1. 背景值过高

• 可能原因：稀释液中载体蛋白或洗涤剂浓度过低，样本与微孔板非特异结合过强；

• 解决方案：适当提高BSA/奶粉浓度（如1%→3%），或增加Tween-20含量（0.05%→0.1%）；同时检查稀释液制备过程中是否有微生物污染，导致细菌分泌蛋白质引发背景。

2. 标准曲线不平直，线性范围窄

• 可能原因：稀释液基质与样本基质不匹配；

• 解决方案：采用矩阵匹配稀释液或稀释后标准品在同一背景下制备；若稀释后仍出现曲线扭曲，可重新调整标准品或样本稀释倍数。

3. 回收率偏低

• 可能原因：稀释液中缺少保护蛋白，样本中目标分子被吸附或降解；

• 解决方案：添加0.1%–0.5% BSA或明胶；对于易被蛋白酶降解的目标，可加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。

4. 检测灵敏度不满足要求

• 可能原因：稀释液的盐浓度或pH不在最佳范围，影响酶活或抗体结合；

• 解决方案：根据酶标实验体系，调整缓冲液pH至推荐值（HRP多在pH 7.0–7.4，ALP在pH 9.5）；将NaCl浓度控制在100–150 mM，避免高盐抑制结合反应。

5. 样品沉淀或浑浊

• 可能原因：稀释液与样本中盐浓度或溶剂不兼容，导致蛋白或脂质沉淀；

• 解决方案：若样本脂溶性成分多，可适当减少有机溶剂添加；冲淡稀释液盐浓度；必要时预先离心或过滤样本，去除大颗粒。