一、样品采集与初步处理

1. 样品类型与采集要求

在酶联免疫吸附（ELISA）等微孔板检测中，常见的样品包括血清、血浆、尿液、细胞培养上清、组织匀浆等。不同样品来源具有特定的采集注意事项：

• 血清/血浆：采血管应选择含凝血剂或抗凝剂的真空管，避免血液溶血。采血后应及时于4℃条件下静置30分钟，使血液自然凝固或保存抗凝状态，然后进行离心。

• 细胞培养上清：收集培养皿或瓶中上清时，应避免吸入细胞碎片。先行低速离心（如300–500×g，5–10分钟），去除残留细胞，然后将上清移至无菌容器保存。

• 组织匀浆：取少量组织块置于预冷生理盐水或缓冲液中，利用匀浆仪在冰上快速研磨。匀浆后须立即以高转速（如10 000×g，10–15分钟）离心，弃去细胞碎片，保留上清作为待测样品。

为避免蛋白酶降解或炎症介质降解，应全程保持样品低温（4 ℃或冰浴），并可以根据需要添加蛋白酶抑制剂或抗氧化剂。采集后应尽快完成离心分离，将上清或血清/血浆分装于预标记的离心管中，避免反复冻融，并且在−20 ℃或−80 ℃条件下保存。如果实验当天即用，可将样品短期置于4 ℃冰箱。

2. 样品离心与去杂质

对于血液、组织匀浆、细胞上清等含有可见颗粒的样本，需进行离心以去除悬浮物。一般采用微量离心机，设定合适的转速与时间：

• 血清/血浆：1200–2000×g离心10–15分钟，弃去血细胞与血块，取上清。

• 细胞培养上清：300–500×g离心5–10分钟，去除贴壁或浮游细胞，再进一步1000–2000×g离心以去微小残渣。

• 组织匀浆：先低速离心（800×g，10分钟）去大块残渣，再高速离心（10 000×g，10–15分钟）获得纯净上清。

若含脂类物质或淋巴细胞等干扰明显，可以在常规离心基础上追加过滤步骤：通过0.22 μm或0.45 μm滤膜，将上清进一步澄清，去除细胞碎片与微颗粒，保证后续检测时光路畅通，避免微粒散射产生假信号。

二、样品保存与稳定性控制

1. 冷冻保存与冻融次数

生物样品中蛋白质、抗体、抗原、酶等易受温度和反复冻融影响。采集后分装于多只离心管中，每支管体积应与单次使用量匹配，避免同一管多次冻融。

• 短期保存：可放置于4 ℃冰箱，使用周期不超过48小时。

• 长期保存：置于−20 ℃或更低（−80 ℃），保存时间可视分子稳定性而定，一般不超过半年。

• 冻融次数：建议不超过两次，否则易导致蛋白变性、酶活丧失或抗体效价下降。若样品标本量有限，可在解冻后分装小份，避免重冻。

2. 添加保护剂与稳定剂

某些脆弱分子（如细胞因子、酶、细胞外囊泡）在冻存或室温放置过程中易失活，可在样品中添加低浓度蛋白稳定剂（如牛血清白蛋白 BSA 0.1%–1%）或甘油（5%–10%）及蛋白酶抑制剂混合物，维护蛋白天然构象，避免降解。加入前应确认所加试剂与后续试剂兼容，不会影响酶标检测反应。

三、样品前处理常用方法

1. 稀释与缓冲液配制

稀释剂常选用厂家配套的稀释缓冲液或自行配制PBS（磷酸盐缓冲液）/TBS（Tris缓冲盐水），需保证pH 7.2–7.4且含0.05%–0.1%吐温 20/80以减少非特异结合。稀释过程应在冰上进行，将样品轻轻颠倒或旋涡混匀，防止产生气泡。

• 稀释倍数：根据预实验结果与待测浓度范围，选择合适倍数，如1:2、1:5、1:10、1:50、1:100等。

• 浓度线性范围：要保证稀释后样本浓度落在标准曲线范围内，如若仍超出，可继续加大稀释倍数。

• 同批制备：一旦选择稀释体系，尽量一次配制足量，分装后放于冰上使用，减少因各次配制造成的批间差异。

2. 蛋白沉淀与去除干扰物

对于血清、尿液或组织匀浆中含有过量脂类、盐类、核酸或小分子杂质时，可借助蛋白沉淀或脱脂步骤，提高样本纯度：

• 硫酸铵沉淀：逐步加入饱和硫酸铵溶液至样本中，边滴加边轻轻颠倒，待过夜4 ℃沉淀，再以10 000×g离心，保留上清或重悬沉淀，具体方法需根据待测蛋白性质调整。

• 有机溶剂沉淀：如冰乙腈或冰丙酮，体积比可选1:3或1:4。充分混匀后置于−20 ℃冷冻20–30分钟，使蛋白质沉淀，再离心后弃上清，重悬沉淀于适量缓冲液。此法对去除小分子代谢物、脂溶性物质较为有效。

• 滤过与超滤：使用截留分子量为10–30 kDa的超滤离心管，可同时去除低分子杂质并浓缩样本。若待测蛋白分子量小于10 kDa，则需改用更小截留值的超滤膜，或结合其他纯化方法。

无论采用何种沉淀或过滤步骤，都要在操作过程中保持低温，防止蛋白失活。处理后的样本需再次检测浓度，并根据实际浓度重新设计稀释倍数。

四、标准品、对照品及试剂配制

1. 标准曲线与质控样本

准确配置标准品溶液是获得精准浓度测定结果的关键。依据厂商说明书或文献，配制标准品初始储备液后，依次进行系列梯度稀释：

• 步骤示例：假设最高浓度为2000 pg/mL，则在标准缓冲液中配置原始浓度溶液后，可依次稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL等多级梯度，最后配制零标准（仅含稀释缓冲液）。

• 准确移液：使用校准合格的移液枪，先向空管内加入标准缓冲液，再注入标准品溶液，充分混匀后再进行下一级稀释。切忌先加标准品后再加缓冲，避免浓度误差。

• 质控样本：除标准品外，还应设立高、中、低浓度的质控样本，用于验证检测的准确度与精密度。常见做法是在空白䐉（Blank）与标准品之外配置三个不同浓度水平的质控样本，一并上板。

2. 探针与显色底物配制

不同检测模式下需要配制不同的二抗/酶标记抗体和显色底物。例如：

• HRP-TMB体系：将TMB显色底物A液（有机缓冲液）与B液（过氧化物酶底物）按推荐比例1:1配制，使用前需避光保存；过量制备会导致底物失效，故应现配现用。

• AP-P-Nitrophenyl Phosphate体系：若使用碱性磷酸酶为酶标签，应配制即用型P-NPP显色液，并在测量后数分钟即进行吸光度读数，因为显色速度较快，最多持续30分钟而不宜过久。

• 荧光与化学发光体系：对于荧光探针，需配制荧光底物与增强剂，常见的底物为R123、AMC等；化学发光检测时，可直接使用Luminol混合液，但需提前调试最佳检测时间与温度。

对于所有试剂配制，应严格按照产品说明书或文献建议，使用 Milli-Q 级高纯水与分析纯试剂，避免微量杂质带来的背景噪声。配制完成后需标注配制日期，并存放于规定温度（一般4 ℃）或避光条件下。

五、微孔板预处理与上样操作

1. 板材选择与预处理

根据检测需求，选择合适的微孔板类型（平底/锥底/黑底/白底）。若为光吸收测定，需选用透明平底板；荧光检测则宜使用黑底板以减少反射干扰；化学发光检测常选白底板提高信号通量。

• 预热与平衡：使用前应将板从4 ℃或−20 ℃环境平衡至室温，至少放置30分钟，以免温差导致反应速率不均。

• 如需包被：若为自建ELISA，需将捕获抗体按浓度加入板孔（如1–10 μg/mL），4 ℃过夜或37 ℃2小时固定，然后用封闭液（通常为5%–10%脱脂乳粉或BSA）室温孵育1–2小时，最后洗板并甩干，方可进行样品上样。

2. 样品与标准品加样

将样品、标准品、质控品及空白按照预先设计的版式依次加至微孔板中，通常包括平行复孔（≥2孔）以降低偶然误差。注意如下要点：

• 移液顺序：先加标准品，再加样本，最后加检测抗体或显色底物。移液枪吸头要保持干净，一次性吸头切勿重复使用，防止交叉污染。

• 避免气泡：移液时须保持移液枪与孔壁稍微倾斜，先触及孔壁再挤压活塞，吹跑液体尾端残留时轻拍管壁让气泡浮出。若气泡停留在孔底，可用细针轻轻拨动，切勿用手挤压微孔板表面。

• 体积一致性：标准品与样品加样体积要一致，例如同为100 μL/孔，确保各孔比色反应体积相同，以减少光路差异对信号的影响。

3. 孵育与摇床设置

加样完成后，根据实验方案将板放入孵育箱或70 × 100 mm摇床，其中摇板速度与时间需严格控制：

• 温度控制：常见ELISA孵育温度为37 ℃或室温（20–25 ℃）。若需要较长孵育（≥2小时），建议采用恒温箱保持温度均一。

• 震荡方式：微孔板上可加装振荡架（Orbital Shaker），设置振荡频率在200–300 rpm，以保证孔内液体充分接触孔壁与抗原抗体，促进反应。

• 孵育时间：捕获抗体与样品结合一般需1–2小时；二抗结合也约需30分钟–1小时；若使用HRP-TMB显色底物，显色时间一般为5–15分钟，应根据色深情况实时监测并终止反应。

六、洗板与显色步骤

1. 洗板程序与注意事项

洗板步骤主要用于去除未结合物，减少背景信号。洗板液常选用含0.05%–0.1%吐温 20的PBS或TBS，具体洗板次数视实验灵敏度要求而定：

• 手动洗板：使用移液器逐孔吸去孔内液体，然后加入300–400 μL洗板液，反复吸弃并轻拍板底甩干。手动洗板需格外注意洗液完全进入孔底，且每孔洗净后略作停留（5–10秒）方可吸弃。

• 自动洗板机：可根据厂家程序设定吸液压力与注液速度，一般设置5–6次冲洗，每次300–400 μL。自动洗板机的喷嘴要定期更换与校准，以防喷嘴堵塞或洗液喷射不均。

• 甩干方式：洗完后，倒扣微孔板于吸水纸或无纤维脱落纸上，轻轻拍打孔板侧壁，甩去残余液体，避免液滴残留影响后续显色均匀性。

2. 加显色液与终止反应

• 显色液加入：取显色底物以相同体积（如100 μL/孔）加入各孔，随后快速盖板或轻轻覆盖，防止空气氧化加速反应。

• 显色情况监测：若显色底物反应速度较快，每隔1–2分钟检查一次孔色变化。理想状态应由无色逐渐变为黄色（HRP-TMB体系），或由淡蓝色变为橙黄色（S-P体系）。

• 终止反应：当标准品最高浓度孔显色达到预定OD值（如0.8–1.0 OD）时，向每孔加入等体积终止液（如2 M硫酸或0.5 M氢氧化钠），轻轻晃动试板，使终止液与显色液充分混合。终止后颜色由蓝色或绿色瞬间转变为黄色，可强化信号稳定性。

终止后应在30分钟内于酶标仪上进行读数，超过此时间可能出现信号漂移或受光线干扰造成误差。

七、检测前准备与读板设置

1. 空白校准与仪器预热

在启用酶标仪进行读数前，需要完成以下准备：

• 空白孔设置：在微孔板内至少留出2–4孔空白（加入终止液或稀释缓冲液），用于校准仪器基线。

• 预热仪器：若酶标仪具备加温功能，需预热至设定温度（如37 ℃或室温保持），并运行空读程序，校正光学参数与探测器零点。

• 波长与检测模式：根据显色体系或荧光/发光体系选择适当波长（例如450 nm，背景扣除550–620 nm），或荧光激发/发射波长设置。

• 增益与读数速度：对于信号较弱的样品可适当提高探测器增益（Gain），但需避免饱和。读数速度可选“快速”或“正常”，针对高通量时可适度加快。

2. 防止环境干扰

• 光源隔离：检测时应关闭实验室照明或将板置于遮光罩内，避免周围强光对荧光/发光信号造成干扰。

• 防振措施：仪器应放置于稳固无震的实验台上，附近尽量避免大型机器运行，以免机械震动影响光路对准与测量精度。

• 温度稳定：读数前后尽量保持环境温度恒定，避免因温差产生的光学折射变化导致信号波动。

八、质量控制与常见问题排查

1. 平行复孔与对照验证

• 复孔数量：建议样品、标准品和质控样本至少进行两到三个重复孔。通过计算样本复孔间的相对标准偏差（%CV），若CV＞10%–15%，需重新检查操作步骤与样本均匀性。

• 阴阳性对照：设立已知阳性和阴性对照，以验证试剂效价与操作准确性。如阴性对照出现高信号，可能是洗板不彻底或交叉污染所致；阳性对照信号异常偏低，则需检查抗体活性或孵育条件。

• 空白对照：空白孔（仅含终止液或稀释缓冲液）应显示极低或接近零的OD值。如空白值明显偏高，需检查显色底物是否过期、洗板机管路是否残留底物、微孔板质量是否有缺陷。

2. 常见误差来源与纠正方法

• 气泡导致信号异常：加样或显色过程中若存在气泡，会造成光散射导致读数偏高。可使用移液器轻轻吹打孔壁使气泡浮出，确保孔底透明。

• 洗板不充分：洗液残留会与底物或检测抗体发生非特异反应，增加背景噪声。建议适当增加冲洗次数（≥5次），并保证甩干完全。

• 试剂配制不准确：显色底物或稀释缓冲液配制量不足或浓度偏差，会影响显色速度与终止效果。务必严格称量和移液，并将配制过程记录在案。

• 移液器校准问题：移液器吸排液体容积不准确会导致加样量不一致，建议每月校准一次或购置二次供液移液枪。

• 温度波动影响反应动力学：孵育温度过高或过低会改变抗体与抗原结合速率，导致曲线斜率变化。使用恒温箱或孵育器保持一致温度，并在相同温度环境下进行全部实验步骤。