酶标仪TR-FRET与常规FRET有何不同？
近年来，随着时间分辨荧光技术（Time-Resolved Fluorescence, TRF）的发展，FRET与TRF技术融合，形成了**时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）**这一更高灵敏度、背景噪声更低的检测方式。TR-FRET已被大量应用于高通量筛选（HTS）、靶向药物发现和抗体亲和力评估等领域，成为酶标仪中用于分子识别与筛选的新型荧光技术。
酶标仪TR-FRET与常规FRET有何不同：原理机制、检测方式与应用场景的系统比较研究
一、引言
荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）是一种基于距离依赖的能量转移机制，被广泛用于研究分子间相互作用、蛋白构象变化和信号通路活动。传统FRET技术因其实时、非破坏性的检测优势，已成为细胞生物学与生物化学领域的重要工具。
近年来，随着时间分辨荧光技术（Time-Resolved Fluorescence, TRF）的发展，FRET与TRF技术融合，形成了**时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）**这一更高灵敏度、背景噪声更低的检测方式。TR-FRET已被大量应用于高通量筛选（HTS）、靶向药物发现和抗体亲和力评估等领域，成为酶标仪中用于分子识别与筛选的新型荧光技术。
本文将从理论原理、检测体系、信号机制、仪器配置、实验设计及应用范围等角度出发，系统比较酶标仪TR-FRET与常规FRET之间的差异，并分析其各自适用的实验场景与未来发展趋势。
二、FRET与TR-FRET的基本原理差异
2.1 FRET机制简介
FRET是一种非辐射能量转移过程，当激发光照射供体荧光团（Donor）后，如果受体荧光团（Acceptor）距离足够接近（1–10 nm），供体的激发能可通过偶极耦合方式传递给受体，使其产生荧光发射。FRET效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，是研究生物分子相互作用的“纳米尺”。
2.2 TR-FRET核心原理
TR-FRET将传统FRET技术与时间分辨荧光（TRF）相结合，采用长寿命荧光供体（如铕Eu³⁺、铽Tb³⁺等稀土离子螯合物），通过延迟读取（通常延迟50–150微秒）信号来避开背景自发荧光，从而极大提高信噪比和灵敏度。
2.3 本质区别
| 项目 | 常规FRET | TR-FRET |
|---|---|---|
| 能量供体 | 有机染料、荧光蛋白（如CFP） | 稀土金属螯合物（如Eu³⁺、Tb³⁺） |
| 能量受体 | 荧光素、染料（如YFP、Cy5） | 长寿命染料（如Allophycocyanin） |
| 信号读取方式 | 实时同步读取 | 激发后延迟读取 |
| 背景抑制能力 | 弱 | 强（可滤除自发荧光） |
| 灵敏度 | 中 | 高（适用于低丰度检测） |
| 时间分辨需求 | 无 | 必须依赖专用酶标仪读数系统 |
三、检测系统构成与设备差异
3.1 仪器系统配置
常规FRET
可使用常规荧光酶标仪或共聚焦显微镜完成检测，需配置多个激发/发射滤光片以分别监测供体和受体发射光。
TR-FRET
需配置时间分辨荧光酶标仪，具备：
3.2 读数方式
| 步骤 | 常规FRET | TR-FRET |
|---|---|---|
| 激发波长 | 通常在400–500 nm | 通常340–355 nm |
| 读取时间 | 与激发同步（毫秒级） | 延迟读取（微秒级） |
| 信号比值 | FRET比 = 受体/供体发射强度 | TR-FRET比 = 665nm/620nm 发光强度 |
四、技术性能对比分析
4.1 灵敏度与背景抑制能力
TR-FRET通过延迟时间窗口采集信号，滤除短寿命的样本背景荧光（如细胞内色素、溶液散射），大幅提高信噪比（SNR）。传统FRET信号易被自发荧光与光漂白干扰，信号重叠明显。
4.2 数据稳定性与重复性
由于采用金属螯合物发光体系，TR-FRET信号稳定性更强，尤其适用于多孔板大规模实验；而常规FRET依赖有机荧光团，存在光漂白和荧光猝灭问题。
4.3 实验通量与自动化兼容性
TR-FRET实验体系多为“添加即测”（homogeneous, no-wash），无需洗板与显色，适合自动化高通量筛选；而传统FRET常用于细胞成像或蛋白重组体系，通量受限。
4.4 技术限制
TR-FRET需专用读板仪器与标记试剂，初期成本较高；而常规FRET实验灵活性较强，适合自由设计标记组合，但信号弱、重复性差。
五、实验设计与操作流程差异
5.1 常规FRET操作流程（以细胞实验为例）
转染含FRET荧光蛋白对（如CFP-YFP）；
培养细胞并施加处理；
使用共聚焦显微镜或酶标仪读取CFP与YFP信号；
计算FRET比或FRET效率（例如，FRET = YFP/CFP）；
分析信号变化以反映蛋白互作或结构变化。
5.2 TR-FRET操作流程（以免疫筛选为例）
准备标记抗体（供体标记抗体与受体标记抗体）；
加入样品与TR-FRET试剂混合于96孔板中；
孵育特定时间；
使用TR-FRET酶标仪设定延迟时间窗口；
读取620/665 nm荧光并计算比值；
用标准曲线或Z′分析筛选阳性结果。
六、典型应用场景对比
| 应用方向 | 常规FRET | TR-FRET |
|---|---|---|
| 蛋白互作成像 | ✔（如BRET、CFP–YFP） | ✖（不适用于活细胞） |
| 信号通路动态监测 | ✔（GPCR、Ca²⁺信号） | ✖ |
| 高通量分子筛选 | ✖ | ✔（G-protein、激酶抑制） |
| 免疫结合检测 | 可行但灵敏度有限 | ✔（无洗免疫分析） |
| 小分子竞争实验 | 低效 | ✔（广泛用于药筛） |
七、TR-FRET应用实例解析
7.1 受体-配体结合筛选（GPCR药物靶点）
采用TR-FRET抗体识别GPCR结构域结合小分子，激发后监测620/665 nm比值变化，实现高通量筛选候选药物，典型Z′值可达0.8以上。
7.2 抗体亲和力分析
通过双抗体夹心体系（供体+受体），检测抗体与抗原结合的程度与动力学，用TR-FRET比值构建浓度响应曲线，广泛用于生物药开发。
7.3 激酶活性监测
将磷酸化底物标记为FRET受体，结合金属供体探针，在激酶作用下发生磷酸化改变FRET距离，从而实时反映酶活变化。
八、发展趋势与结语
8.1 技术融合趋势
TR-FRET与AlphaLISA、HTRF（Cisbio专利技术）等无洗免疫检测技术正逐步融合，形成更加稳定、高通量、全自动的分子检测平台。
8.2 仪器智能化发展
未来酶标仪将集成多通道激发/发射系统与AI分析软件，实现TR-FRET数据实时监控、曲线自动回归、细胞状态辅助判断等功能。
8.3 结论总结
TR-FRET与传统FRET在原理、检测方式、信号处理、实验操作与应用领域均具有显著差异。常规FRET适用于可视化分析与基础研究，TR-FRET则凭借其高灵敏度、背景抑制与通量优势，正成为高端药物筛选与免疫检测的主流技术。
