酶标仪FRET检测的原理与注意事项

一、引言

荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种分子间相互作用研究的重要技术，近年来在分子生物学、细胞信号转导、药物筛选与蛋白功能研究中发挥着重要作用。由于其灵敏度高、分辨率细、无需物理接触即可感知相互作用，FRET已逐渐成为生命科学研究的“显微探针”。

随着现代酶标仪功能的不断拓展与升级，FRET实验已从传统荧光显微镜转向高通量平台的微孔板系统。通过优化光源、滤光片和通道设置，酶标仪能够实现对FRET信号的高效检测，为大规模蛋白相互作用筛查与高内涵分析提供了新途径。

本文将围绕FRET在酶标仪平台下的原理、实验设计、影响因素与关键注意事项展开系统论述，帮助研究者精准实施FRET检测，提高数据的可靠性与生物解释力。

二、FRET原理基础

2.1 什么是FRET？

FRET是一种非辐射能量转移现象，发生在两个近距离荧光团（染料）之间：一个是供体（Donor），一个是受体（Acceptor）。当供体分子被特定波长激发后，在没有发射自身荧光的情况下，通过电偶极相互作用将能量“传递”给受体分子，使后者发生荧光发射。

2.2 FRET产生的必要条件

• 空间接近：供体与受体之间距离需小于10 nm；

• 光谱重叠：供体的发射光谱与受体的激发光谱需显著重叠；

• 相对取向合适：两个分子的偶极方向需符合共振条件；

• 染料稳定：荧光团应具备高量子产率、抗光漂白性。

2.3 FRET效率

FRET的能量转移效率（E）定义为：

E=11+(r/R0)6E = \frac{1}{1 + (r/R_0)^6}E=1+(r/R0)61

其中：

• $r$ 为供体与受体之间的距离；

• R0R_0R0 为FRET距离半径（效率为50%时的距离，通常为2–8 nm）。

这使FRET成为极其敏感的“分子标尺”。

三、FRET在酶标仪中的检测方式

3.1 检测策略概述

在酶标仪中，FRET检测通常采用光谱分辨检测法（spectral detection），通过在激发供体的同时，分别监测供体发射光（ExD/EmD）与受体发射光（ExD/EmA）。

其中，ExD 是供体的激发波长，EmD/EmA 为供体/受体的发射波长。

3.2 常用FRET荧光团对

3.3 酶标仪检测模式优势

• 高通量：可同时检测96/384孔板中的多个样本；

• 自动化：便于批量分析和实验重复；

• 灵敏度稳定：仪器稳定性强于显微镜定量；

• 动态可控：适合实时FRET动力学跟踪。

四、FRET实验的设计与流程

4.1 实验体系构建

• 构建供体-受体融合蛋白质或标记分子；

• 优选高表达系统（如哺乳动物细胞、细菌表达）；

• 确保供受体比例适当，避免过表达带来自荧干扰。

4.2 孔板选择与处理

• 选择黑色、透明底96孔板或384孔板；

• 孔板底部要求低自发荧光、低背景；

• 用PBS或HEPES缓冲液洗净孔底，避免残留杂质干扰。

4.3 检测步骤

1. 设定激发/发射滤光片通道（ExD/EmD，ExD/EmA）；

2. 读取空白值（无染料对照）；

3. 读取供体单标样本信号；

4. 读取受体单标样本信号；

5. 读取FRET共标样本信号；

6. 计算FRET效率指标（见下）。

五、FRET数据处理方法

5.1 FRET信号的定量表达

常用计算方法包括：

（1）比率法

FRET Ratio=EmA(ExD)EmD(ExD)\text{FRET Ratio} = \frac{\text{Em}_{\text{A}}(\text{ExD})}{\text{Em}_{\text{D}}(\text{ExD})}FRET Ratio=EmD(ExD)EmA(ExD)

简单实用，适合半定量分析。

（2）校正后FRET强度（Corrected FRET, cFRET）

cFRET=D-Araw−α⋅D-D−β⋅A-A\text{cFRET} = \text{D-A}_{\text{raw}} - \alpha \cdot \text{D-D} - \beta \cdot \text{A-A}cFRET=D-Araw−α⋅D-D−β⋅A-A

其中：

• $\alpha$：供体对受体通道的串扰系数；

• $\beta$：受体激发造成的自发光分量。

（3）归一化FRET（NFRET）

用于校正光源强度和表达水平差异：

NFRET=cFRETD-D⋅A-A\text{NFRET} = \frac{\text{cFRET}}{\sqrt{\text{D-D} \cdot \text{A-A}}}NFRET=D-D⋅A-AcFRET

5.2 时间分辨FRET（TR-FRET）

• 增加延时检测窗口，减少背景；

• 常用于免疫检测平台（如HTRF）；

• 灵敏度高，适用于低丰度蛋白检测。

六、实验注意事项与常见问题

6.1 激发/发射通道选择合理性

• 避免光谱交叉严重的荧光团对；

• 校准滤光片中心波长与半高宽（FWHM）；

• 检查供体激发是否误激受体通道。

6.2 控制背景信号

• 空白孔、单标记控制孔必须设置；

• 使用抗自发荧光孔板和缓冲液；

• 注意培养液中不含有自发荧光成分（如酚红）。

6.3 染料标记效率与比例控制

• 建议进行标记率验证；

• 保持供体与受体摩尔比1:1最为理想；

• 过度标记易造成信号淹没和淬灭。

6.4 避免光漂白

• 控制曝光时间；

• 开启“快速读取”模式减少光照；

• 使用抗漂白剂或抗氧化缓冲液（如ProLong）。

6.5 孔间差异控制

• 统一加样体积；

• 控制板边孔效应；

• 仪器使用前进行自动校准（尤其是高通量设备）。

七、FRET在酶标仪中的应用实例

7.1 蛋白-蛋白互作分析

• 经典应用：研究Ras-Raf、Akt-mTOR等信号通路蛋白互作；

• 使用GFP-RFP或CFP-YFP融合蛋白；

• 可绘制剂量响应曲线，计算EC₅₀值。

7.2 高通量药物筛选

• 利用FRET变化反映抑制剂作用；

• 常用于激酶、酶-底物干预剂筛选；

• 结合自动化酶标仪可实现每天>10,000反应监测。

7.3 DNA/蛋白构象变化探测

• 用FRET对标识DNA折叠、蛋白构象重排；

• 可用于研究突变、pH、Ca²⁺对结构的影响。

八、发展趋势与技术融合

8.1 微流控与FRET联用

• 降低样品用量；

• 实现细胞级空间分辨的动态FRET检测。

8.2 与AI算法联动分析

• 通过机器学习判定FRET模式变化；

• 精确识别异常相互作用或筛选靶标。

8.3 多色FRET系统发展

• 扩展至3~4色FRET，提高多重检测能力；

• 应用于多通道药物-靶点交互解析。