一、引言

荧光法是酶标仪最核心的检测模式之一，因其具有高灵敏度、高选择性和非放射性的优点，被广泛应用于酶活性测定、细胞功能分析、蛋白质-核酸检测、免疫标记等实验中。在荧光法中，荧光探针（fluorescent probe）是实现检测的关键分子。荧光探针能够在特定波长的激发光照射下，发射出特定波长的荧光，从而通过酶标仪读取其发射强度，实现对目标分析物的定量或定性分析。

荧光探针的种类繁多，其性能包括激发波长、发射波长、量子产率、光稳定性、pH敏感性等均影响其在酶标仪检测中的表现和适用范围。本文将系统介绍酶标仪荧光法中常用的荧光探针类型，分析其结构特征、性能参数、适用检测体系和最新应用进展，旨在为实验设计、结果分析及探针选择提供详实参考。

二、荧光探针的基本特征与分类方法

1. 基本原理

荧光探针通过激发电子跃迁发光，其特性由下列因素共同决定：

• 激发波长（Ex）与发射波长（Em）：决定酶标仪滤光片或单色器设置；

• 斯托克斯位移（Stokes Shift）：越大越易于分离信号与背景；

• 量子产率（Quantum Yield）：反映发光效率；

• 光稳定性：抗光漂白能力强的探针更适合长时间监测；

• 溶解性与亲水性：影响细胞成像与水溶体系兼容性。

2. 分类方式

荧光探针可按不同方式分类：

• 按荧光发色团分类：如荧光素类、罗丹明类、半胱黄素类、BODIPY、氰ine染料等；

• 按功能机制分类：

• 反应型探针（如Amplex Red，受氧化后变为荧光物）；

• 结合型探针（如FITC标记抗体）；

• 靶向型探针（如MitoTracker）；

• 按应用领域分类：

• 酶底物类探针；

• 金属离子探针；

• 活性氧/氮类探针；

• 核酸染料类探针。

三、常用荧光探针类型及其应用

1. 荧光素类探针（Fluorescein and derivatives）

**代表：**FITC（荧光素异硫氰酸酯）、FAM（羧基荧光素）等
**激发/发射波长：**约495 / 520 nm
特点：

• 良好的水溶性；

• 常用于蛋白、抗体、寡核苷酸标记；

• FITC已广泛商业化，适合ELISA和免疫分析。

应用实例：
FITC标记抗体用于流式细胞术与免疫组化；FAM用于TaqMan荧光探针法实时PCR中。

2. 氰ine染料（Cyanine Dyes）

**代表：**Cy3、Cy5、Cy7等
**波长范围：**从550/570 nm到750/770 nm
优势：

• 激发波长跨度大，适合多重检测；

• Cy5在远红外波段背景干扰少，信噪比高；

• 可通过合成调节结构以控制光谱特性。

**应用：**多通道荧光成像、FRET（荧光共振能量转移）分析、核酸杂交芯片。

3. 罗丹明类（Rhodamine dyes）

**代表：**TRITC（四甲基罗丹明）、Rhodamine B、R6G
**波长：**550–580 nm激发，580–620 nm发射
特点：

• 荧光强度高，稳定性好；

• 荷电结构便于偶联到生物分子上；

• 与FITC可组合用于双重标记。

**典型应用：**细胞定位、细胞骨架染色、胞内pH测定。

4. BODIPY染料（Boron-Dipyrromethene）

**波长：**激发/发射通常在500–510 nm / 510–530 nm之间
优势：

• 高量子产率；

• 对pH、极性环境不敏感；

• 荧光尖锐、带宽窄，适合多色共存。

**用途：**脂滴成像、膜电位测定、脂质氧化研究。

5. 半胱黄素类探针（Coumarin dyes）

**代表：**7-羟基-4-甲基香豆素（HMC）、AMC、MCA
**激发/发射波长：**约360–380 / 440–460 nm
**适用：**酯酶、水解酶活性监测；HPLC/CE结合检测。

四、功能型荧光探针专题分析

1. 氧化酶底物类探针

**代表：**Amplex Red

• HRP催化下与H₂O₂反应生成Resorufin（Ex/Em = 563/587 nm）；

• 高灵敏度，常用于检测谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢、胆碱等代谢产物。

2. 活性氧/氮（ROS/RNS）探针

3. 钙离子探针

Fluo-3、Fura-2、Indo-1等钙敏感探针广泛用于胞内钙离子浓度变化的动态监测，配合荧光酶标仪实现高通量钙成像。

4. 核酸染料类探针

**代表：**PicoGreen、SYBR Green、Hoechst

• PicoGreen用于双链DNA；

• Hoechst适用于细胞核成像（Ex/Em = 350/461 nm）；

• SYBR Green广泛用于实时荧光定量PCR。

五、多重荧光探针的配伍与酶标仪配置

在多通道酶标仪中，多探针共存检测已成为常规操作。为避免信号串扰，需考虑：

• 发射波长分离度：一般需相差≥30 nm；

• 激发滤光片可切换性：保证不同探针激发效率；

• 探针浓度调配与比值计算：用于FRET、Ca²⁺比值分析。

例如，使用FITC（520 nm）与Cy5（670 nm）双探针标记不同目标蛋白，结合荧光比率法监测其空间共定位。

六、探针的选择策略与实验注意事项

1. 选择依据

• 检测靶点的类型（酶、离子、蛋白、DNA等）；

• 所用酶标仪滤光片配置；

• 所需灵敏度与背景噪声水平；

• 是否需要多重探针共用。

2. 使用注意事项

• 避免光漂白：探针溶液避光操作；

• 温度与pH适配性验证；

• 防止自荧光干扰：使用低自荧背景的培养基或缓冲液；

• 标准曲线校正：使用已知浓度荧光标准品验证线性响应。

七、最新发展方向与前沿进展

• 近红外荧光探针（NIR probes）：背景低、穿透强，适合组织检测与动物模型；

• 自增强探针（Turn-on probes）：仅在结合/反应后才发光，信噪比极高；

• 环境响应型探针：能感应微环境如pH、电势、氧分压；

• 智能探针平台：结合人工智能推荐探针组合与波长匹配；

• 光遗传与激光调控探针：用于活体调控信号网络。

八、结语

荧光探针作为酶标仪荧光法检测的核心分子，其选择与使用直接影响实验的信号强度、特异性、定量准确性和数据重现性。从传统FITC、Rhodamine到现代BODIPY、Cy染料及近红外探针，荧光探针体系日趋完善与多样化。随着光谱工程、分子成像和纳米技术的发展，未来荧光探针将在多维检测、活体成像和个性化医学中发挥更加重要的作用。研究者应根据具体实验需求合理选配探针种类与组合，同时加强对仪器参数与数据解读的精准控制，提升酶标仪荧光法检测的科学性与实用性。