酶标仪比色法常用的试剂有哪些？
一、引言
酶标仪比色法是一种基于显色反应的光学检测技术，其核心思想是在微孔板中通过酶促或非酶促化学反应生成具有特定吸光特性的产物，通过测量其吸光度（OD值）判断目标物质浓度或反应强度。相比荧光、化学发光等检测方式，比色法因其操作简便、成本较低、仪器兼容性强而被广泛应用于以下实验领域：
在上述实验中，试剂的选择直接影响反应效率、显色质量与数据稳定性，因此理解常用比色试剂的种类与性质，是优化实验设计和保障数据质量的关键。
二、酶标仪比色法试剂的基本类型
根据比色反应机制和试剂作用方式，可将常用比色试剂分为以下几类：
酶底物类（酶促显色）
金属螯合指示剂类
偶联反应显色剂类
化学还原染料类
酚类氧化染料类
染料络合物生成类
以下逐一展开分析。
三、酶底物类试剂
3.1 TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）
原理：
TMB在过氧化氢存在下被辣根过氧化物酶（HRP）催化氧化，生成蓝色产物，在450 nm波长下测定（加终止液后变黄）。
优点：
高灵敏度，显色迅速；
稳定性好，背景低；
常用于ELISA检测。
注意事项：
避光保存，防止自动氧化；
加终止液前控制显色时间。
3.2 ABTS（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）
原理：
在HRP作用下与过氧化氢反应，生成绿色显色产物，吸收峰在405 nm。
特点：
反应温和，适用于多种HRP体系；
可长时间稳定显色。
局限：
灵敏度略低于TMB；
长时间放置可能颜色漂移。
3.3 OPD（o-Phenylenediamine Dihydrochloride）
原理：
在HRP和H₂O₂存在下生成橙黄色产物，吸收峰在492 nm。
优势：
显色迅速，适用于快速ELISA；
色泽稳定性好。
缺点：
对光敏感；
有一定毒性，操作需防护。
3.4 PNPP（p-Nitrophenyl phosphate）
原理：
碱性磷酸酶（ALP）催化PNPP水解生成黄色对硝基苯酚，测量波长405 nm。
应用：
常用于双酶体系（HRP+ALP）中的ALP检测；
适合长期孵育体系。
四、金属螯合显色试剂
4.1 BCA（Bicinchoninic Acid）
原理：
蛋白与Cu²⁺反应还原为Cu⁺，后与BCA形成紫色络合物，在562 nm波长下检测。
应用：
蛋白定量，线性范围广；
可抗多种化合物干扰。
优点：
颜色稳定，适合微量蛋白；
精确度高，重复性好。
4.2 Bradfords Reagent（考马斯亮蓝 G-250）
原理：
染料与蛋白质结合后吸收峰从465 nm转移至595 nm，颜色由棕红转蓝。
特点：
快速简便，无需加热；
对精氨酸与碱性氨基酸敏感。
局限：
某些缓冲液会影响结果；
稳定性不如BCA法。
五、偶联显色体系类试剂
5.1 NBT/BCIP（Nitro Blue Tetrazolium / 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）
原理：
在ALP作用下，BCIP被水解生成产物与NBT还原生成蓝紫色沉淀。
应用：
用于膜上免疫检测（Western blot）；
也可在比色法中半定量使用。
特点：
颜色沉积不溶于水，适合图像分析；
显色持续时间长。
六、化学还原染料类试剂
6.1 MTT（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）
原理：
活细胞将MTT还原为紫色甲瓒结晶，溶于DMSO后在570 nm处测量。
应用：
细胞活性与增殖分析；
药物毒性实验。
局限：
需终止剂溶解结晶；
某些药物会干扰还原反应。
6.2 WST-1 / CCK-8（基于formazan盐类）
原理：
类似MTT，但反应产物溶于水，无需终止溶解。
优点：
无毒，实时检测；
操作更简便，灵敏度更高。
七、染料络合与配位反应类
7.1 Ferrozine、Ferene-S
原理：
与Fe²⁺形成紫红色络合物，可在562–593 nm处比色。
应用：
铁含量测定；
环境水样或血清检测。
7.2 Eriochrome Black T、Methyl Orange等pH或金属指示剂
说明：
多用于离子浓度比色；
可适用于化学环境监测、水质检测等。
八、试剂选择与实验优化建议
| 试剂名称 | 适用酶 | 吸收波长 | 显色强度 | 灵敏度 | 稳定性 | 应用领域 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| TMB | HRP | 450 nm | 高 | 高 | 中等 | ELISA, HRP标记 |
| ABTS | HRP | 405 nm | 中 | 中 | 高 | 环境酶分析 |
| OPD | HRP | 492 nm | 中高 | 高 | 低 | 快速免疫试验 |
| PNPP | ALP | 405 nm | 中 | 中 | 高 | 酶活性分析 |
| BCA | Cu²⁺ | 562 nm | 高 | 高 | 高 | 蛋白质定量 |
| MTT | NADH | 570 nm | 高 | 中 | 中等 | 细胞毒性 |
| CCK-8 | NADH | 450 nm | 高 | 高 | 高 | 无毒增殖检测 |
九、使用注意事项与质量控制
光敏性试剂：TMB、OPD需避光使用；
反应时间控制：应统一终止反应时间，避免OD漂移；
终止液兼容性：某些终止液会影响染料结构，需选配适宜酸碱性；
加样一致性：体积差异会影响比色结果；
孔间交叉污染：操作中避免飞溅与液滴残留。
十、结语
比色试剂作为酶标仪比色法的核心组成，其种类繁多、机理复杂、性能各异。合理选择比色试剂需基于检测指标、酶种、敏感度、样品类型与实验目的。TMB、ABTS、OPD等HRP体系底物仍是ELISA的主力军；BCA和Bradford在蛋白定量方面各有千秋；WST-1与CCK-8代表着细胞功能分析试剂的发展趋势。随着实验通量与检测复杂度的提升，未来比色试剂将朝着高灵敏度、快速显色、环境友好、智能化响应等方向发展。
