酶标仪加样模块的精度如何校验？
一、引言
在微孔板检测（如ELISA、核酸扩增、细胞实验等）中，加样模块（pipetting module）负责将液体试剂或样品准确、稳定地分配到各个孔位，其精度和准确度直接影响实验数据的可靠性。随着高通量检测需求的增加，自动化加样设备应用日益普及，但其中潜在的误差来源也更多。若加样模块未经有效校验，即使仪器读数精准，也无法保证实验结果的真实性。因此，对加样模块进行系统性精度校验，是做好质量控制、保证检测结果一致性的重要环节。
二、加样模块概述
1. 加样方式分类
手动移液：借助手动或多通道移液器（micropipette）完成分液，依赖操作人员技能，易受人为因素影响。
分液工作站：半自动或全自动的液体处理平台，通常配备电动移液器头、机械手臂和液面探测系统，可对接多种板型。
集成式微孔读数仪内置加样：在某些酶标仪或PCR系统中，厂商将加样模块与检测模块集成，既可加样又能实时读取光学信号或荧光信号。
2. 组成与主要部件
移液头或吸头模块：由若干根可更换或固定的吸头组成，可覆盖单通道、多通道乃至全板通道；内部包含活塞、弹簧及密封圈，用于驱动吸液与排液。
移液控制系统：包括电机、导轨与齿轮，负责控制吸头上下运动及进样体积的精确定位。部分高端设备带有压电振荡或气压控制模块，以提高体积精度。
液面探测器：常见原理有电容式、压力式或光学式，用于检测吸头与液面接触时的精准时刻，从而保证移液体积一致。
废液回收与清洗系统：在连续加样过程中，需要清洗吸头或管路，以防止交叉污染；废液通常由泵浦导入收集槽。
三、精度与准确度概念
在加样模块校验中，需要明确“两大核心指标”的定义：
准确度（Accuracy）：指实际分配体积与标称体积（即设定体积）之间的接近程度，可用偏差（Error）或百分比偏离（%Deviation）表示。
精密度（Precision）：指在相同条件下重复分配时，各次测量结果的接近程度。常用相对标准偏差（Coefficient of Variation，CV）来量化，CV 越低，表明重复性越好。
准确度与精密度既相互关联，又相互独立。理想状态下，加样模块既要保证每次分液与标称体积接近（高准确度），又要保证多次分液数据波动小（高精密度）；二者均满足实验要求，才能实现数据的一致性和可靠性。
四、校验必要性与目标
1. 影响实验结果的主要因素
机械磨损与老化：长期使用后，移液器活塞密封圈、弹簧等部件会出现磨损，导致吸液速度和排液体积发生偏差。
温度与空气湿度：液体粘度与蒸发速度随环境温度、湿度变化而变化，尤其对小体积（≤5 μL）分液影响更大。
管路气泡与漏液：管路内若存在微小气泡，会引起移液体积突变；管路连接不紧密或吸头与活塞接触不良，也会导致泄漏。
操作误差与软件误差：半自动设备若未校准液面探测高度，或软件算法出现偏差，都会直接影响每次移液体积。
2. 校验目标
验证当前状态：判断加样模块在不同体积设定下的准确度和精密度是否符合设备说明书或行业标准。
发现并排除故障点：通过系统校验，可识别出密封不严、吸头泄漏、气泡积聚、活塞定位错误等隐患，并及时维护。
建立基线与趋势监测：定期记录校验数据，建立设备性能基线；通过对比趋势曲线，可提前预警加样系统性能下降或异常。
满足质量体系要求：实验室在建立ISO/IEC 17025、GMP、GLP等质量管理体系时，必须有加样模块校验记录，确保实验可追溯性。
五、常用校验方法
1. 重量法（Gravimetric Method）
1.1 原理
利用高精度天平直接称量吸取液体后容器质量的变化，将质量（mg）转换为体积（μL）。由于水在特定温度下具有已知密度，可通过公式：
复制编辑体积（μL）= 质量（mg）÷ 密度（mg/μL）
计算出实际移液体积。该方法操作简单、成本低，但需严格控制环境温度与空气流动。
1.2 仪器与用品
高精度分析天平：分辨率至少为0.01 mg（0.00001 g），读数稳定，抗环境振动能力强。
容器或称量瓶：一般预先选用小称量纸或塑料称量盘，保证表面干净且不吸水。
蒸馏水或去离子水：用于测试，需提前平衡至实验室环境温度。
校验记录表与台式计算器：记录每次称量结果并计算体积差异。
1.3 操作步骤
天平预处理：打开天平，静置至少30分钟，确保内部温度与室温平衡。
校准密度：在校验前记录实验室环境温度（℃），参照水的密度表得出对应密度值（mg/μL）。
准备称量容器：将称量容器置于天平，记录初始质量M1；如需重复使用，注意保持容器干燥且无残液。
设定移液体积：根据设备要求，将加样模块依次分别设定为低、中、高三个测试体积（如10 μL、50 μL、200 μL）。
执行移液并称量：启动分液程序，将设定体积的蒸馏水吸入移液头并排入称量容器中，读出质量M2。重复至少十次（或更多）以获取数据。
计算实际体积与偏差：对每次实验，计算质量差ΔM＝M2－M1，再依据水密度D计算体积V＝ΔM÷D。统计每次V值，计算平均值、标准偏差与CV，并与标称体积比较，得出偏差百分比（%Deviation）。
分析结果：若平均体积与标称体积偏差超出设备说明书或行业标准允许范围，则需进行维护或校正；若CV值较高，则表明重复性不足，需要排查系统振动或操作不当原因。
1.4 注意事项
温湿度控制：称量过程中避免强气流，用风罩或防风玻璃罩保护天平；室温波动过大会影响水密度计算，应在校验前后记录温度。
蒸发误差：低体积移液（<5 μL）时，水蒸发速度较快，需加快称量速度，或在短时间内完成多次称重。
称量容器选择：容器应轻便、表面积小，以减少水膜吸附；称量纸表面不宜过于粗糙，以免吸附悬液影响精度。
消除静电干扰：天平附近不可带塑料、橡胶等易产生静电的物品，实验者需在称量前用接地装置排除静电。
2. 比色法（Colorimetric Method）
2.1 原理
利用某些可溶性色素（如Phloxine B、试剂盒配套的染料）稀释后在特定波长下具有稳定的吸光度，通过比色测量各孔吸光度值，与标准曲线比对，反推出单孔的移液体积。该方法可同时检测多通道，加快检测速度。
2.2 仪器与用品
标准颜料溶液：需提前制备不同浓度梯度的比色标准，以建立浓度-吸光度的线性关系。
纯水与试剂：用于稀释及清洗吸头。
多通道酶标吸头：与被测试设备对应，避免规格不匹配导致结果偏差。
2.3 操作步骤
标准曲线制备：根据颜料分光系数，准备一系列已知浓度的染料溶液（如0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL等），用酶标板每孔加入固定体积（如100 μL），在检测波长下读取吸光度，绘制浓度-吸光度曲线并确认线性范围。
设备预温与试剂准备：将染料溶液及稀释后的纯水置于设备工作室温平衡10-15分钟，吸头清洗完毕。
设定移液体积并分液：依次将系统设定为预定体积（如20 μL、100 μL、300 μL），将染料溶液或纯水吸入，并分到酶标板相应孔位中。建议每个体积设置至少八个重复孔，以确保数据可靠。
比色测量：使用酶标仪在染料最大吸收峰波长处读取各孔吸光度。然后根据标准曲线，将吸光度换算为染料浓度，即可计算出每孔实际体积：
复制编辑实际体积（μL）=（测得浓度 × 分液总体积）÷ 原始浓度
统计分析：计算每个设定体积组的平均值与标准偏差，并与标称体积作对比，得出偏差百分比与CV。若偏差或CV超出允许范围，需进行调校。
2.4 注意事项
线性范围确认：染料浓度不要超出酶标仪线性检测范围，否则吸光度测量饱和，影响计算准确度。
洗头清洁：每次更换体积或测试样本时，均应用稀释液彻底清洗吸头，以避免残留染料影响下次测量。
温度一致：染料溶液温度应与实验室温度相同，以免吸光度随温度变化产生漂移。
光路校准：在比色法前可使用酶标板空白孔进行背景扣除，以消除板面本底吸光度对测量结果的影响。
3. 荧光法（Fluorometric Method）
3.1 原理
以荧光染料（如荧光素、荧光素异硫氰酸酯FITC等）为标记，移液后测量板孔中特定波长下的荧光强度，将荧光信号与标准曲线对比，换算出实际移液体积。该方法灵敏度高，尤其适合微量（<1 μL）分液的校验。
3.2 仪器与用品
荧光酶标仪：带有荧光读数功能，支持指定波长激发与发射检测。
荧光染料标准溶液：需先建立浓度-荧光强度的线性关系。
低荧光板（black plate）：减少背景信号干扰，提高检测灵敏度。
吸头与试剂：与比色法如出一辙，但需确保试剂本身无荧光干扰。
3.3 操作步骤
荧光标准曲线绘制：配制一系列荧光染料溶液（如0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL等），将固定体积（如50 μL）分装到黑色96孔板中，测定荧光强度，并构建浓度-荧光强度曲线。
温度与荧光稳定性确认：荧光染料对温度敏感，实验前需在室温10分钟平衡；若染料易光漂白，则在黑暗中操作，减少测量误差。
设定与分液：同样将移液模块依次设为低、中、高三个体积水平（如1 μL、5 μL、20 μL），将染料溶液吸入移液头并排放至黑板孔中，保证每个体积至少六个以上重复孔。
荧光测量与数据换算：使用酶标仪的荧光检测模块，设定相应激发波长与发射波长，读取各孔荧光强度值；根据标准曲线换算出染料浓度，结合分液总量换算为实际移液体积。
误差分析：计算平均值与标准偏差，并与标称体积比较。若CV值过高或偏差过大，则须检查反应体系稳定性、仪器灵敏度与加样路径是否存在污染。
3.4 注意事项
荧光基质清洁：使用专用低荧光底板，避免普通板自带荧光背景干扰。
保护样品避光：荧光染料易光漂白，应在黑暗或弱光环境下进行配置与测量。
仪器预热：荧光酶标仪需预热后测量，以保证荧光检测器状态稳定。
染料稳定性：不同荧光染料的光漂白速度不同，实验间隔时间要统一，避免因荧光衰减导致数据偏差。
4. 放射性示踪法
4.1 原理
使用放射性核素标记的示踪液（如³H、¹⁴C等），在吸头移液后测定各孔放射性计数值，通过与标准放射性浓度比对换算体积。放射性示踪法灵敏度极高，但因涉及放射性同位素管理，仅限于特定科研机构或生产厂家使用。
4.2 仪器与用品
放射性计数仪（β计数器）：可对微量放射性标记样本进行精确计数。
放射性示踪液：需获得相关管理部门审批，并具备完整的安全操作规程。
低放射背景板：避免普通塑料板对放射线的吸收与散射。
辐射安全设备：包括屏蔽柜、防护手套及废液收集装置等。
4.3 操作步骤
安全审核与备案：在进行放射性示踪法前，必须按照国家或地区放射性安全管理规定，完成实验室备案、人员培训与防护物资准备。
示踪液配制：将放射性同位素溶于缓冲液中，配制成已知浓度的示踪液，建立放射性活度-体积标准曲线。
移液与计数：按既定体积设置移液程序，将示踪液移入低背景板孔中；取板进行β计数，读取各孔活度计数值。
数据换算：根据标准曲线，将每孔实际活度换算为示踪液体积。对多次重复移液数据进行统计，计算平均移液量、偏差及CV。
安全处置：移液完成后，将所有含放射性废液统一收集，按照放射性废弃物处理规范进行处理，实验场地需进行辐射污染检测。
4.4 注意事项
严格安全措施：操作人员需进行防护培训，穿戴铅胶手套、实验服、面罩等，专用安检设备需常规维护。
时效性考量：某些同位素半衰期较短，需及时使用并在测量前后记录活度变化进行修正。
降低背景干扰：尽量避免现场其他放射源对示踪液测量的干扰，并做好环境辐射监测记录。
5. 体积校对法（Volumetric Check）
5.1 原理
借助已校准移液量程与标准移液管（如校准过的规定体积吸量管、定容管）对加样模块进行交叉验证，即先使用移液管准确量取某一体积液体，再将该体积液体分配至酶标板，通过比较移液管与设备分液结果，评估加样模块的准确度与精密度。
5.2 仪器与用品
标准移液管与定容容量瓶：经专业机构校准，误差在允许范围内。
色标或示踪液：为便于肉眼观察，可使用带色液体。
96孔或384孔板：根据仪器适配。
高精度台式天平或酶标仪：用于验证移液管与探头分液后的质量或吸光度。
5.3 操作步骤
校准移液管：将标准移液管校正到指定体积，并使用蒸馏水进行验收，记录其实际体积。
分液对比：使用经校准移液管（如100 μL）向板孔中分装100 μL彩色溶液，并测量各孔吸光度或重量；再用待检加样模块依设定参数（100 μL）分装相同溶液，并对相同孔位进行测量。
差异计算：将加样模块测量值与标准移液管测量值进行比对，得出偏离程度。建议在三个不同体积（如10 μL、50 μL、200 μL）进行测试，并分别进行十次重复。
数据统计：对误差值进行汇总，计算平均绝对偏差及相对偏差，并评价其在标准限值内与否。
5.4 注意事项
移液管精度验证：确保所用移液管本身精度可靠，否则会引入系统性误差。
操作一致性：移液管和加样模块的吸排液方式不同，操作速度与吸头浸没深度需保持一致，以减少人为变异。
颜色浓度选择：颜色溶液浓度不宜过高或过低，否则测量时会出现吸光度偏离线性范围的问题。
六、校验标准与行业规范
1. 国际标准参考
ISO 8655-2：关于移液器准确度和精密度的国际标准，适用于移液设备的检验与校准，详细规定了移液体积范围、测试次数、允许偏差及CV限值等指标。
CLSI EP06-A：Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）发布的“Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods”，适用于评估定量测量方法（包括自动移液系统）的重复性与再现性。
ASTM E1154 / E1158：美国材料与试验协会（ASTM）关于滴定系统与自动移液器精度校准和检查方法的规范文件。
2. 国内行业规范
YY/T 0287-2016《医用诊断试剂 酶联免疫试验通用要求》：对ELISA检测中相关仪器校准与质量控制提出技术要求，包括移液设备的校正。
JJG 939-2014《移液器检定规程》：由国家计量技术规范制定，明确了移液器的检定项目、检定方法与允许误差。
国家食品安全标准（GB）：若用于食品检验领域，如GB/T 21923“食品微生物快速检测技术通则”中，移液精度也被纳入质量监控范畴。
3. 参考限值与判断
低体积移液（≤10 μL）：允许偏差一般不超过±1 μL，CV不超过3%。
中体积移液（10–100 μL）：偏差允许范围为±1%–2%，CV不超过1.5%。
高体积移液（100–1000 μL）：偏差允许范围为±0.5%–1%，CV不超过1%。
超高体积（>1000 μL）：偏差允许范围可放宽至±1%，CV不超过1%。
各行业或设备厂商会根据自身要求进行更严格的定义，在校验时必须参照具体说明书或实验室标准。
