一、技术原理与应用背景

1.1 多步加样概念

在酶联免疫吸附实验（ELISA）等生物检测中，常见的加样方式有一步加样（一口添加所有试剂）、两步加样（先加样本/抗原，再加入检测试剂或显色底物）以及三步加样（如先加抗体、再加二抗、最后加入显色底物）。两步/三级加样能够灵活控制每一步反应条件，减少交叉干扰、提高灵敏度和特异性。例如：

• 两步加样：先将样本与捕获抗体结合、孵育、洗板，去除非特异结合后，再加入酶标识别抗体或显色底物进行二次反应，最后读取吸光度。

• 三级加样：常见于间接ELISA或竞争ELISA。第一步加样本与捕获抗原/抗体结合；第二步加入酶标结合物（如酶标二抗或竞争抗原）；第三步加入底物显色并终止反应后检测。

相较于一步法，两步/三级加样可通过分段孵育与洗板降低背景信号，提高检测准确性和动态范围，但同时对仪器软件逻辑及操作规范提出更高要求。

1.2 应用场景

1. 夹心ELISA：如测定细胞因子（IL-6、TNF-α）时，常先加入捕获抗体包被板，再加样本；其后加入酶标检测抗体；最后加底物显色，便于灵敏定量。

2. 间接ELISA：如检测试料中的抗体浓度时，先加样本（含待测抗体），孵育后洗板，再加酶标二抗，最后加底物显色。

3. 竞争ELISA：先加标记抗原与样本中待测抗原竞争结合，再加酶标二抗或直接加底物，利用吸光度反比计算浓度。

4. 细胞活力/凋亡实验：如CCK-8、MTT或LDH检测，若需要先对细胞进行药物处理、洗去药物后再加显色底物，则需分多步加样。

不同实验目的决定具体加样步骤与时间，因此需要灵活设置两步或三级加样策略，以便在同一孔板上完成一整套连续流程。

二、仪器与试剂准备

2.1 仪器配置

1. 酶标仪本体：需具备自动孵育与洗板功能时，需配备带温控及板式清洗模块的酶标仪。若仅读取吸光度，则普通微孔板阅读器亦可兼容多步加样方案，但需人工转移/移除板盖并针对每一步完成后手动洗板或孵育。

2. 自动加样工作站（可选）：若实验量大、要求高通量，建议搭配液体处理工作站（如机器人加样系统），可编程执行精准移液、摇匀与分段洗板，大幅减少人为误差。

3. 多通道移液器或单道移液器：确保每步加样体积一致、误差控制在±1%。两步/三级加样时，各通道需校准准确。

4. 洗板仪：若仪器配有内置洗板模块，可在软件流程中设定自动洗板次数及吸液、加液速率；否则需手动洗板，并在加样步骤之间预留洗板时间。

2.2 软件与驱动

1. 专用控制软件：不同酶标仪品牌（如BioTek、Molecular Devices、Thermo Fisher、Tecan等）都有自带的程序编辑软件，用于定义多步加样流程、设定孵育温度/时间、洗板参数以及最后读取波长。

2. 驱动安装：确保已在操作系统中安装对应USB串口或以太网驱动，使软件可识别仪器并正常通信。若是网络连接型号，还需确认IP地址、端口号与防火墙策略设置正确。

3. 用户权限：Windows平台下，若软件需要写注册表或创建系统服务，需以管理员权限运行；Linux或macOS下也需确保对应账号对驱动和设备节点具有读写权限。

2.3 试剂与板材

1. 板材选择：一般使用96孔透明聚苯乙烯板；若实验需要荧光检测，则选择黑底荧光板；对于比色显色（如TMB显色），需保证孔底透光率一致。板体应选同一品牌、同一批号，以减少孔间、批次误差。

2. 捕获抗体或包被抗原：根据实验方案，需先包被第一步结合配体（抗体或抗原），放置4 °C过夜或37 °C 2小时后封闭。

3. 二抗与酶标底物：在两步加样中，第二步为加入酶标二抗或直接加入HRP标记结合物；在三级加样中，第二步为加入检测抗体（可非标记），第三步为加入酶标结合物（如酶标二抗）或直接底物显色。若是竞争法，则第二步为特异竞争抗原或酶标抗原；第三步直接显色。

三、两步加样方案配置

3.1 实验原理与流程概览

“两步加样”常见于直接/夹心ELISA，基本流程如下：

1. 第一步加样：加待测样本或标准品至预先包被捕获抗体的孔中，孵育后洗板。

2. 第二步加样：加HRP标记的检测抗体/酶标二抗或直接加显色底物，孵育后终止反应并读取吸光度。

相较于一步加样，洗板操作更及时，能去除非特异结合，背景值更低；且二抗与底物可按同一程序设定。

3.2 软件界面设置（以示例软件“Gen5”或“SoftMax Pro”为例，其他品牌软件类似）

1. 创建新方法（Method）：进入软件主界面，点击“New Protocol”或“New Method”。

2. 命名与基本信息：在弹出窗口输入方法名称（如“TwoStep_ELISA”）、板类型（96孔标准板）、检测波长（如OD450 nm，参比OD620 nm）。

3. 步骤1：加样与孵育

• 在“Protocol Steps”中，点击“Add Step”，选择“Incubate/Shake”类型。

• 设置“加样体积”（如50 μL），此处仅是软件记录，用于实验记录与提示，不会自动移液，若联用自动工作站可与之对接。

• 设置“孵育温度”（如37 °C）及“孵育时间”（如60 min）；如果仪器不带加样功能，此处只是记录孵育条件，移液仍需手动完成。

• 添加“Wash Plate”动作，在“Wash Parameters”中，设定洗板次数（如3次），每次加液体积（如300 μL PBST），甩干时间（如5 s）。

4. 步骤2：二抗加样与孵育

• 再次点击“Add Step”，选择“Dispense”类型，将加样体积设为50 μL，软件界面可提示操作人员加入酶标二抗。

• 点击“Incubate/Shake”，设置温度（如37 °C）和时间（如30 min），同样可在软件中勾选“Shake”选项，设置摇板速度（如300 rpm）。

• 添加第二次“Wash Plate”动作，设置相应参数（如4次洗板），确保去除游离酶标抗体。

5. 步骤3：底物显色与终止

• 点击“Add Step”，选择“Dispense”类型，加显色底物（如TMB）100 μL。此处软件界面可提示用户操作；若仪器具备自动移液模块，可自动完成。

• 点击“Incubate/Shake”，设定显色时间（如15 min，无温控或25 °C 常温即可）。

• 点击“Dispense”类型或“Stop Reaction”类型，根据仪器选项添加“终止液”（如50 μL 2 M硫酸）。

6. 步骤4：读取吸光度

• 在“Add Step”中，选择“Read”类型，设定测量波长（450 nm）与参比波长（如620 nm），并设置读数速度（如标准速度或快速模式）。

7. 保存与导出：完成所有步骤后，点击“Save”或“Export Method”，并将该方法保存于仪器操作列表中，以便下次直接调用。

3.3 实验细节与注意事项

1. 移液顺序与均匀性：尽量采用多通道移液器或自动加样器，避免逐孔加样时产生时间梯度。若手动加样，应按照每行或每列依次进行，保证同一板中各孔处理误差 < 1 min。

2. 洗板强度与彻底性：洗板步骤对去除非特异结合尤为关键，每次洗涤务必确保残留液体几乎完全除去，否则会带来高背景。软件中设定的“甩干”时间不可过短，以免残液。

3. 孵育温度控制：若仪器自带温控模块，则在软件中勾选“温控”选项；若无温控，则需在实际操作中放置于独立恒温箱或37 °C 孵育箱中，保持温度稳定。软件设定的温度仅用于提示操作人员，并记录在实验日志。

4. 终止时机精准把握：底物与终止液需及时加入，多数TMB/硫酸体系对终止时间十分敏感，±30 s 即会影响吸光度。因此，建议根据软件提示或计时器在同一平台同时添加终止液并快速移至读数位置。

5. 空白孔与对照孔设置：两步加样法中，空白孔指不加任何抗原和检测抗体，仅加底物与终止液。阴性对照孔可仅加样本稀释液，阳性对照孔加已知浓度的标准品。软件中可为每个孔自定义“Sample ID”以便后续数据归类与导出。

四、三级加样方案配置

4.1 实验原理与流程概览

三级加样方式常用于间接ELISA或竞争ELISA，典型流程如下：

1. 第一步加样：加待测样本（含未标记抗体）至包被抗原的孔中，孵育后洗板。

2. 第二步加样：加酶标二抗（针对第一步结合物的二级抗体），孵育后洗板。

3. 第三步加样：加底物显色并终止反应，读取吸光度。

若是竞争ELISA，则第一步为样本与酶标抗原共同加入；第二步为结合与清洗；第三步为底物显色。

4.2 软件界面设置（以示例软件“KC4”或“Magellan”软件为例）

1. 方法创建：在主界面点击“New Assay”或“New Protocol”，输入名称“ThreeStep_ELISA”，选择板型及孔盘布局。

2. 步骤1：样本加样与孵育

• 添加“Add Reagent”动作，将样本（或样本+酶标抗原混合液）加至各孔，记录体积（如100 μL）。

• 添加“Incubate”动作，勾选“温控”，设定37 °C，时间60 min；若软件支持摇动，可选“摇动”并设速率（300 rpm）。

• 添加“Wash Plate”，设定洗涤缓冲（如1×PBST）、洗板次数（3次）、吸液速度及甩干时间。

3. 步骤2：二抗加样与孵育

• 添加“Add Reagent”，选择酶标二抗（如HRP-标记山羊抗兔IgG），体积50 μL。软件会在仪器屏幕上提示更换试剂瓶或移液管。

• 添加“Incubate”，温度37 °C，时间30 min；若需摇动则勾选“Shake”。

• 添加“Wash Plate”，设定如4次洗涤、每次300 μL、水浴甩干5 s。

4. 步骤3：显色与终止

• 添加“Add Reagent”，底物TMB 100 μL，无温控或设置25 °C。

• 添加“Incubate”，时间为15 min，无需洗板；如果需要摇动，可设300 rpm。

• 添加“Add Reagent”，加入2 M硫酸50 μL，结束显色。

5. 步骤4：读取吸光度

• 添加“Read Plate”，选择测量波长450 nm，参比波长620 nm；可根据底物类型选择其它波长（如ABTS 405 nm）。

• 若软件支持重复读取，可在“Read Plate”中设置多次读取间隔，监测显色曲线动态变化。

6. 节省试剂与时间优化

• 在“Wash Plate”动作中，可启用“泡沫吸收”或“预吸/后吸”模式，提高洗涤彻底性；

• 若某一步骤不需要温控，如常温抗体孵育，可将温度选项关闭，仅记录时间。

4.3 实验细节与注意事项

1. 反应方案验证：三级加样中，第一步与第二步的孵育条件对结合效率至关重要。切忌因缩短时间或取消温控，导致一级抗体或二抗结合不足，影响最终信号强度。

2. 酶标二抗稀释浓度：二抗稀释度需经过梯度优化，以获得适宜的信噪比；若二抗浓度过高，则加样-洗板后仍有非特异吸附；过低则导致灵敏度下降。软件界面中可为不同板行或列设置不同稀释度模板，但建议每次实验使用同一稀释度以保持一致性。

3. 竞争ELISA特别注意：若采用竞争方案，第一步加样需同时加入样本与固定浓度的酶标抗原，并充分混匀。此时软件中“Add Reagent”可设定混合模式（摇匀或定速搅拌），保证混合均匀。竞争反应时间也需要事先实验验证，一般为60 min。

4. 显色稳定性与终止时间：与两步加样类似，显色时间与终止时间的准确控制决定吸光度的可重复性。最好使用自动加样模块或定时器控制每个孔间显色时间差 ≤1 min。

5. 数据处理与标准曲线拟合：三级加样往往用于定量型实验，需要构建标准曲线。软件中可在“Analysis”界面选择4PL 或 5PL曲线拟合，输入标准品浓度及对应OD值后自动计算未知样本浓度。注意选择“Log（浓度）”或“Linear（浓度）”模式时的不同，以免拟合失真。

五、常见问题与故障排查

5.1 软件无法识别加样步骤

• 原因：仪器型号与软件版本不匹配，或者控制模块未启用多步加样功能。

• 排查：查看厂家说明书，确认所购型号支持“Sequencing”或“Reagent Dispense”模块；若需要插件授权，请联系厂家激活。此外，检查USB/以太网连接是否稳定，端口号是否正确配置。

5.2 加样提示与实际操作不同步

• 原因：软件中设定的加样体积与实际移液器体积不一致，例如将自动加样体积设为100 μL，但实际用50 μL多通道移液器操作。

• 排查：在“Protocol Steps”中审阅每一步体积设定，并结合实验操作手册确认。若实际不使用自动加样模块，可将“Dispense”动作的体积设为0，仅用于提示操作人员“该加样”而不控制实际移液。

5.3 洗板不彻底导致高背景

• 原因：洗板程序中的“吸液”时间过短或“甩干”步骤未启用；洗涤缓冲液配制或水质有问题；管道或喷头堵塞。

• 排查：进入“Wash Settings”，检查“Pre-Soak Time”与“Post-Soak Time”是否合理（一般为5–10 s）；确保吸液泵压力正常，喷头针头未弯曲或堵塞。定期使用去离子水冲洗管道，并更换洗涤缓冲。

5.4 孵育温度偏差或恒温失败

• 原因：仪器温控模块故障或温度传感器校准不准。

• 排查：使用校准温度计在孵育腔内不同位置测量，确认显示值与实际温度是否相符；若出入超过±0.5 °C，则需联系厂商进行校准或更换传感器。软件中设定的温度仅供参考，若温差较大会严重影响结果。

5.5 数据波动大，重复性差

• 原因：多步操作间时间间隔不一致，移液速度不均匀；吸光度读取条件（如光强衰减、镜头脏污）未校准。

• 排查：确保实验时按软件提示连续操作，避免一次性加完所有孔再开始计时；使用自动加样或多通道移液器提高一致性；定期清洁比色池，做空白校准或仪器维护。