一、引言

酶标仪作为实验室高通量检测的核心装备，通过对微孔板中样品的光学信号（吸光度、荧光、化学发光等）进行高灵敏度读数，实现对酶促反应、蛋白定量、核酸定量、药物筛选等多种实验的自动化和并行化。随着科研与工业需求的不断增长，微孔板的孔密度从传统的96孔向384孔、1536孔等更高通道方向发展，以节省样本与试剂、提高检测通量。然而，不同孔板在孔径、孔距、体积、光路分布等方面存在显著差异，酶标仪在读取时必须相应调整硬件与软件参数，否则易造成信号损失、背景干扰或数据偏差。因此，掌握如何针对96孔、384孔、1536孔板进行酶标仪检测，对于提升实验效率、保证结果可靠性至关重要。本文将从仪器配置、参数设置、操作流程、优化策略及常见问题等方面，系统阐述三种孔板的检测要点与注意事项，以期为实验室人员提供切实可行的技术指导。

二、微孔板类型简介

1. 96孔板

• 孔径与孔距：每孔孔径约为6.4 mm，孔距（中心距）为9 mm。

• 单孔容积：一般参考容积约300 µL，上限约350–360 µL。常见平底、U型或V型底。

• 应用场景：最为常见的格式，广泛用于ELISA、蛋白定量、酶动力学等实验。操作相对宽松，易于手工移液。

2. 384孔板

• 孔径与孔距：每孔孔径约为3.6 mm，孔距为4.5 mm。

• 单孔容积：参考容积约50–100 µL，上限100–120 µL。多数为平底或浅U型底。

• 应用场景：高通量筛选、定量PCR后产物定量、细胞增殖检测等。节省试剂和样本，对移液精度要求较高。

3. 1536孔板

• 孔径与孔距：每孔孔径约1.8 mm，孔距为2.25 mm。

• 单孔容积：参考容积仅10–20 µL，上限约30 µL。

• 应用场景：超高通量药物筛选、高维度组合实验。对仪器精度、温控、移液自动化要求极高，一般在工业化筛选平台中应用多见。

三种孔板在物理尺寸、容积范围、孔间距上存在显著差异，直接影响酶标仪的光路调焦、机械定位、信号灵敏度、边缘效应等方面。因此，分别针对不同格式孔板进行专门的检测设置与优化，是保证实验数据准确可靠的先决条件。

三、酶标仪硬件配置要求

1. 光学系统

• 吸光度模式：采用滤光片轮或单色仪。滤光片轮一般带宽10–20 nm，适合常规比色实验；单色仪可调带宽1–10 nm，更灵活。

• 荧光模式：配备激发滤光片与发射滤光片，或单色器双通道模式。对多色荧光检测，需保证滤光片组合或单色仪带宽足以覆盖常见荧光染料谱系（如FITC、TRITC、Cy5等）。

• 化学发光模式：无需滤光片，核心是一块灵敏度高、噪声低的光电倍增管（PMT）或高灵敏CCD相机。

2. 机械定位平台

• 读板托架需兼容96、384及1536孔板不同尺寸，且机械行程与步距要精准。

• 对于384孔板而言，托架行程需精确至微米级，以确保小孔位也能被光路准确对准；而1536孔板要求更高，要做到孔中心与光束中心的偏差＜0.1 mm。

• 机械臂或读数平台须具备自动对焦功能：通过检测孔底平面或预设高度，实现对不同孔深的自动对焦，尤其对1536孔板微孔高度控制极为关键。

3. 温控与振荡模块

• 温控模块：对于需要恒温反应的实验（如酶动力学、实时荧光定量PCR），需设置可调范围0–45 ℃或更高的恒温单元。温度偏差一般需控制在±0.2 ℃以内。

• 振荡模块：部分酶标仪支持在读取前或读取后进行振荡，可设置振荡时间（如5–10 s）及振荡速度（如200–300 rpm），以保证孔内样品混合均匀。高孔密度板振荡时需注意振幅不可过大，以免样品飞溅或交叉污染。

4. 软件与数据处理系统

• 读板软件需支持多孔板格式选择，可在布局图中标记空白孔、标准曲线孔、样本孔，自动生成浓度-信号曲线。

• 对于384孔与1536孔板，软件界面应支持缩放与快捷布局，以便实验者快速标记120个以上的孔位，节省操作时间。

• 软件内部算法针对不同孔板的信号背景及边缘效应，应提供灵活的背景校正、多重曲线拟合以及异常孔自动标记功能。

四、参数设置与操作流程

1. 公共设置项

无论是96孔、384孔还是1536孔板，以下基本操作步骤与注意事项都适用：

1. 开机预热与校准

• 启动设备后先执行光源预热（一般需5–10 分钟），确保灯泡或激发源的输出稳定。

• 进行系统自检与校准（若仪器支持自动校准），包括光路对准、PMT增益基线重置。

• 确认仪器温控模块正常工作（若需要恒温），并设定合适温度。

2. 选择检测模式

• 在软件菜单中选择Absorbance（吸光度）、Fluorescence（荧光）、Luminescence（化学发光）等对应模式，根据实验体系决定。

• 若需要双波长或荧光双通道校正，提前在菜单中指定参考波长（如吸光度450 nm/630 nm）或选择对应激发/发射对。

3. 孔板格式选择

• 在“Plate Type”或“Plate Format”选项中，选择相匹配的孔板类型：96、384或1536孔。

• 若仪器预设品牌（如Corning、Thermo Scientific等）型号，可直接选择对应品牌与型号；否则选择“Generic 96/384/1536 Flat Bottom”通用选项。

4. 读数速度与焦距调整

• 读取速度（Speed）可选Fast/Normal/Slow，通常96孔板可选Fast或Normal；384孔板选Normal；1536孔板为保证精度，尽量选Slow。

• 聚焦高度（Focus Height）或“Bottom Scan Height”：通常96孔板设定约5–7 mm；384孔板3–4 mm；1536孔板1–2 mm，具体需根据孔深与板材厚度微调。若仪器支持自动对焦，则仅需输入估算值，再按软件提示进行微调。

5. 振荡与延时设置

• 若实验需要读取前混匀，可在“Shake Before Read”勾选并设置时间（如5 s），振荡速度（如250 rpm）。

• 对于荧光或发光实验，可能需要设置“延迟时间”（Delay Time），保证试剂反应充分后再读取，通常设置0.5–1 min。

6. 空白孔与对照孔布局

• 打开软件内置布局图，将空白孔（Blank）、正对照、负对照、标准曲线孔及样本孔依次标注清楚。

• 若需要双波长校正，指定对应的参考孔并勾选“Subtract Blank”或“Dual Wavelength Correction”。

完成以上基础设置后，即可开始填写样品并放置孔板，随后点击“Start”或“Read”开始测量。

2. 96孔板检测流程及优化

1. 孔板与样本准备

• 使用96孔平底透明板进行普通吸光度或荧光实验；若需要减少孔间串光，可选用黑色底板进行荧光实验；若进行化学发光，可选用白色底板增强信号反射。

• 依据试验方案，按列或行做梯度稀释，将空白孔安排在A1–A2或H11–H12等显眼位置，标准曲线孔分布连续，样本孔分组排列，避免交叉。

• 样本体积一般取100–200 µL，以保证孔底液面平整并符合光程要求。

2. 波长设置

• 比色吸光度实验：选择典型波长（如TMB为450 nm，背景校正为630 nm；Bradford蛋白测定为595 nm；核酸测定可选260 nm，但需确认仪器支持UV区）。

• 荧光实验：依据染料特性设置激发/发射对（如FITC Ex = 490 nm/Em = 520 nm；TRITC Ex = 550 nm/Em = 570 nm）；设置带宽10 nm左右。

• 化学发光实验：切换至“Lumi”模式，设置积分时间（0.5–1 s），无需波长选择。

3. 焦距与读取速度

• 聚焦高度设定在5–7 mm（测量点到孔底距离），若仪器带自动对焦，可选“Auto Focus”；若手动微调，可观察实时预览信号强度，找到信号最强点。

• 读取速度推荐选“Normal”；若样品数量较少且信号强度高，可选“Fast”。

4. 振荡与温控

• 若检测如ELISA终点吸光度，读取前建议振荡5 s以充分混匀底物；若已在孵育阶段振荡，可略去。

• 化学发光与荧光实验若对温度敏感，可设定恒温（如37 ℃或25 ℃），并预热至少5 min后再读取。

5. 边缘效应与背景校正

• 96孔板边缘孔易受到蒸发影响，可在边缘孔放置含生理盐水的孔避免温差蒸发；或使用带盖板并配合振荡器恒温培养器减少边缘效应。

• 布局中至少留2–4个空白孔，分布在板中心与边缘，用于扣除背景与板材本底。

6. 数据导出与分析

• 测量结束后，软件自动生成96个孔的读数矩阵，可在软件中直接绘制标准曲线、计算样本浓度。

• 导出数据为Excel或CSV文件，进一步进行统计分析与可视化。

• 若发现某些孔信号异常，可通过软件查看实时光谱或重复单孔扫描验证。

3. 384孔板检测流程及优化

1. 孔板与样本准备

• 选择384孔平底透明板进行吸光度或荧光实验；荧光实验可选用黑色底板以降低串光；化学发光需白色底板。

• 每孔体积一般为20–50 µL，若体积低于20 µL，则可能导致光程不足，信号偏低。建议至少使用30 µL以保证稳定读数。

• 标准曲线孔与样本孔需均匀分布，空白孔至少保留4–6个，并分布在板中心与四周区域。

2. 移液与混匀环节

• 由于孔径较小、孔距仅4.5 mm，手工移液风险高，建议使用多通道移液器或移液机器人。移液器枪头需与孔径匹配，避免体积残留或接触孔壁造成交叉污染。

• 每次移液后，应轻轻拍打板底或置于振荡器上低速振荡1–2 s，使液体与孔壁充分接触并减少气泡。但避免剧烈振荡导致样品溅出。

3. 参数设置

• 孔格式：在软件中选择“384 Flat Bottom”或对应品牌型号。

• 波长与焦距：吸光度设定同96孔板（如450/630 nm双波长）；聚焦高度设定3–4 mm；荧光实验聚焦高度可设定2–3 mm。

• 读取速度：推荐“Slow”或“Normal”模式，因为384孔板每孔体积少，信号相对弱且对光路精度要求高，慢速扫描可提高数据重复性。

4. 振荡与温控

• 读取前振荡5 s，速度建议200–250 rpm；过高振荡速率易导致液体溅出。

• 恒温模块设定平衡时间稍长（约10 min），以保证板内所有孔温度一致。384孔板因孔体积小，受外界温度影响更敏感，恒温稳定性需控制在±0.2 ℃范围。

5. 边缘效应与背景处理

• 384孔板边缘孔更易蒸发与温度偏差，建议边缘孔加入缓冲液（如PBS 50 µL），不用于检测，但可平衡温度与湿度。

• 布局中空白孔至少保留6–8个，分布在四个象限以便均衡扣除背景。

• 若软件支持“Plate Correction”功能，可启用均一性校正（Uniformity Correction），最大限度消除平板光路偏差与底材不均匀影响。

6. 数据处理

• 读取完成后，软件生成16×24的384孔矩阵。可直接绘制标准曲线，并进行平滑过滤，如三次多项式拟合或四参逻辑拟合。

• 可针对384孔板加入“空背景（Background）校正”功能，自动扣除板材本底与光路散射。

• 导出数据后需结合实验对孔位做严格审核，若某个孔信号明显偏离相邻孔，可单独复测或剔除。

4. 1536孔板检测流程及优化

1. 孔板与样本准备

• 1536孔平底透明或带薄膜底；荧光实验推荐黑色底板；化学发光实验推荐白色底板。

• 单孔体积仅5–10 µL，通常推荐使用自动化移液工作站（如Echo Acoustic Liquid Handler、Beckman Coulter Biomek系列）完成移液。手工操作几乎不可能保证精度。

• 标准曲线设计应保留至少10个梯度点，占用一行（32个孔）或更多行；空白孔至少保留16个，分布在板中心与四角。

2. 仪器校准与对焦

• 由于孔径仅1.8 mm，光路目标极为细微，必须先进行高精度自动对焦或手动微调。建议使用仪器的“Fluorescence Top/Bottom Scan”功能进行预扫描，从而找到最佳对焦位置。

• 定期校准机械定位平台，以确保孔位中心与激发/检测光学轴平行。一般需每月或每周针对1536孔板模式进行一次对位校准。

3. 参数设置

• 在软件中选择“1536 Flat Bottom”格式；确认板规格与实际品牌（如Corning 3575、Greiner 789201）保持一致。

• 吸光度检测：目前少见；若厂家支持，可在专用1536吸光度模块中设定波长与参考波长，聚焦高度约1–2 mm；读取速度仅可选“Slow”；

• 荧光检测：设定激发/发射对（如FITC 488/520 nm），带宽设为10 nm；聚焦高度约1 mm；PMT增益需设为“High”或“Auto High”模式，以保证微量信号能够被充分放大。

• 化学发光检测：设定积分时间1 s，延迟时间0 s（底物反应快速峰值释放）；软件一般提供专门的“1536 Lumi”模式。

4. 振荡与温控

• 振荡功能通常不用于1536孔板，因为极低体积会导致溅液或交叉污染。若必须混匀，可使用微振幅高速导流平台或专用微孔板振荡器，绝对禁止剧烈摇晃。

• 恒温要求更严格，一旦温度偏差±0.5 ℃都会在几分钟内因孔内体积小而导致信号偏差。建议将仪器置于恒温实验室或配合外部温控箱使用，并在读取前预热至少15 分钟。

5. 边缘与背景校正

• 1536孔板的边缘效应更为明显，必须在软件中启用“板面均一性校正”（Plate Uniformity Correction），并结合实验设计添加至少16个均匀分布的空白孔。

• 软件可基于空白孔数据计算出整板信号偏移矩阵，并进行二维插值校正，从而减少孔间偏差。

6. 数据分析

• 读取结果生成32×48的1536孔矩阵。由于孔位众多，直接可视化往往不便，建议导出数据后使用专门软件（如Spotfire、Prism或定制脚本）对数据进行批量筛选与可视化。

• 标准曲线拟合时，可采用四参数逻辑回归（4PL）或五参数逻辑回归（5PL），以兼容超高通量筛选中可能出现的非线性数据。

• 对于高通量药物筛选，还需结合Z′因子评估板间一致性与信噪比，若Z′因子<0.5，则需排查实验设置或硬件对焦问题。

五、通用注意事项与优化策略

1. 移液精度与移液器校准

• 随着孔密度增大，对移液精度要求急剧提升。建议定期（至少每月）使用重量法验证移液器精度，并针对384孔、1536孔专用移液器枪头进行校准。

• 高密度板推荐使用自动化移液平台或多道移液器，避免手动十几毫进样误差导致整体结果偏差。

2. 温控环境管理

• 高孔密度板（384与1536）小体积样本对温度波动极为敏感，应尽量将酶标仪置于温度恒定的实验室或使用外置冷/热板配合恒温读数。

• 若仪器自带温控模块温度均一性不足，可在板边缘放置空白孔协助平衡板温，同时缩短从移液到读取的间隔时间，减少温度变化带来的误差。

3. 孔间串光与背景抑制

• 荧光实验时，选择黑色底板（Black Wall, Clear Bottom）可大幅降低孔间串光；吸光度实验避免使用黑色板。

• 化学发光实验则优先使用白色底板以增强反射，但需防止孔间串光，可在软件中开启“Cross-talk Correction”功能。

4. 边缘效应的缓解

• 对于384孔与1536孔板，强烈建议边缘孔不做实际检测，而是填充等体积填充液（如PBS或无菌水）以减少蒸发与温差效应。

• 使用带盖板的微孔板，并在盖子上涂覆一层薄薄的硅油或使用专用密封膜，减少空气对流。

5. 聚焦与对位校准

• 每次切换孔板类型或更换孔板参考样式后，都应进行一次“孔位对位校准”（Plate Alignment）。通过仪器自带的标定程序及校准板（calibration plate），校正读数平台的X/Y移动步距误差与聚焦高度基准。

• 每月或每隔1000次测量后，应对384孔、1536孔板模式进行二次校准，以保证光学对准精度。

6. 读数重复性与数据质量控制

• 对同一样品建议设置2–3个技术重复孔，并分散于同一板不同区域，以规避局部孔板效应。

• 软件可在测量后统计“板内变异系数（Intra-Plate CV）”和“板间变异系数（Inter-Plate CV）”，若CV超过5%（96孔板）或10%（384/1536孔板），应重点检査操作与仪器情况。

六、典型应用案例

案例一：96孔板ELISA检测

1. 需求背景：检测血清中特定细胞因子浓度，采用96孔ELISA试剂盒。

2. 操作流程：

• 孔板类型：96孔平底透明板；

• 样本与标准品：100 µL/孔；空白孔A1–A2；标准曲线B1–B8；样本C1–H12。

• 仪器设置：吸光度模式；主波长450 nm，参考波长630 nm；聚焦高度6 mm；读取速度Normal；Shake Before Read 5 s。

• 边缘孔处理：将H11–H12空余孔置等体积PBS。

3. 数据分析：读取完成后软件自动扣除空白孔均值，生成标准曲线，计算样本浓度。CV一般在3–5%以内。

案例二：384孔药物高通量筛选（HTS）

1. 需求背景：筛选化合物对某酶靶点抑制率，384孔板格式，实现高通量。

2. 操作流程：

• 孔板类型：384孔平底黑底荧光板；每孔体积25 µL（含底物与化合物）；空白孔与对照孔共16个，分布于板角与中间区域。

• 移液方式：使用自动化移液机器人完成底物、酶与化合物分配；振荡器低速振荡2 s后静置30 s。

• 仪器设置：荧光模式；激发波长490 nm（带宽10 nm），发射波长520 nm（带宽10 nm）；聚焦高度3.5 mm；PMT增益设Auto High；读取速度Slow；恒温设置25 ℃。

• 边缘效应：边缘列填充缓冲液，启用软件“Plate Uniformity Correction”。

3. 数据处理：生成16×24孔矩阵；扣除空白与最大抑制对照值，计算抑制率；筛选Z′因子>0.5的合格实验板；数据导出用于后续化合物活性评估。

案例三：1536孔片段筛选

1. 需求背景：在1536孔板中进行小分子片段库筛选，检测酶活发光信号。

2. 操作流程：

• 孔板类型：1536孔平底白底化学发光板；每孔体积6 µL（含酶底物反应体系）。

• 移液方式：使用Echo超声液体处理系统完成5 nL化合物转移与纳升级缓冲液分配；

• 仪器设置：Chemiluminescence/Lumi模式；积分时间1 s；聚焦高度1.0 mm；读取速度仅Slow可选；软件中勾选“1536通道Cross-talk Correction”与“Plate Uniformity Correction”；温控设37 ℃并预热15 min。

• 边缘效应：所有边缘孔不用于检测，仅作温度对照；空白孔至少32个，四角及中心均匀分布。

3. 数据分析：生成32×48孔矩阵；软件自动扣除空白背底并纠正板面不均；导出RLU数据，在筛选过程中计算信号/背景比并判定Hit池；CV要求≤10%，Z′因子≥0.5。