一、底部荧光检测的原理与优势

1.1 底部荧光检测的原理

荧光检测是一种通过激发光激发样本中的荧光分子，使其从激发态返回基态时发射特定波长光子的过程。酶标仪通过激发源发出光信号，照射样本并通过检测器收集荧光发射光，从而得出荧光强度信息。

在底部荧光检测中，激发光从酶标板底部射入，发射光亦从底部收集。这种光路与传统顶部检测（从上方激发和收集）的差异，使得底部检测更适合某些实验场景。

1.2 底部检测的优势

• 适用于贴壁细胞实验：贴壁细胞在微孔板底部生长，底部激发可提高激发光与荧光染料的接触效率，增强信号强度。

• 减少干扰和背景信号：避免了顶端液体表面反光与散射对探测器的影响。

• 利于自动化成像：与显微成像系统接口更便捷，可拓展为高内涵分析平台（HCA）。

• 兼容三维培养与凝胶体系：如肿瘤球、MatriGel 培养物等，其底部信号更集中，顶端激发会受遮挡。

二、底部荧光检测对酶标仪的硬件要求

2.1 光学路径设计

底部检测要求酶标仪具备下行光路结构，即仪器内部需配置独立的底部激发与发射通道，通常包括：

• 底部光源模块：LED、激光器或氙灯等冷光源，需定向向上发射。

• 底部滤光片组或光栅系统：用于选择激发波长和分离发射波段，安装位置需接近底部光路出口。

• 底部收集透镜：高数值孔径（NA）镜头或光纤收集器，用于最大限度地收集发射荧光。

• 高灵敏度检测器：如光电倍增管（PMT）、雪崩光电二极管（APD）或CMOS探测器，需对低强度信号具备良好响应。

底部检测系统往往需要更复杂的光路反射镜和激发滤片排列结构，以实现信号最大化同时避免信号泄漏。

2.2 精密的板位控制系统

酶标板底部荧光检测对孔位对准精度要求极高。每个孔的中心必须准确对齐检测光路中心，才能确保激发光完整照射样品，发射光精准收集。

所需配置包括：

• 高精度X-Y定位平台：可确保微米级别的孔位移动误差（一般要求< ±100 μm）。

• 低振动机械系统：防止光轴震动对信号采集产生干扰。

• 孔位自识别或光轴对准算法：用于自动调整偏差，提高测量一致性。

2.3 板托材质与光学透明性

底部检测必须确保光信号能穿透微孔板底部，因而对板材有严格要求：

• 使用专用底部透光板：如黑色侧壁、透明底（black-wall, clear-bottom）96孔或384孔板。

• 底部平整度高、厚度均一：避免因厚度不一造成光折射偏差。

• 高透光率底材：如聚苯乙烯（PS）、聚碳酸酯（PC）、环烯烃共聚物（COC）等材料，适合可见光激发。

普通纯白或乳白色聚丙烯板底不适合底部检测，因其会反射激发光或屏蔽发射光。

三、底部荧光检测对系统性能的要求

3.1 光源亮度与波长适配

酶标仪的激发光源必须具备如下性能：

• 高强度激发光输出：以补偿激发路径中底部材质透过损失。

• 多个波长可选：匹配常用荧光染料（如FITC、Cy5、Rhodamine、Alexa系列）所需激发波长。

• 可编程波长切换：具备自动滤光片轮换或光栅分光技术，快速调整检测通道。

对于多重荧光标记实验（如双通道、三通道标记），支持多波长串行或并行采集是关键条件。

3.2 检测器灵敏度与噪声控制

底部荧光信号经过酶标板底透传后，信号强度会略低于顶部采集，因此：

• 检测器需要具备极低暗电流与高量子效率；

• 信号放大器需配合自动增益调节（Auto Gain）；

• 支持背景扣除（Background Subtraction）以排除环境杂散光。

优质设备能检测低至数十皮摩尔浓度的染料分子，实现单细胞水平的荧光检测。

3.3 动态范围与线性响应

对于荧光强度差异极大的样本，检测系统应具备宽广的动态范围：

• 线性范围需达到5–6个数量级；

• 可通过多次积分测量取平均，提高信号稳定性；

• 配备光程校正功能者，可纠正板底不平或液面高度差异造成的误差。

四、酶标仪软件对底部荧光检测的支持

4.1 操作界面支持底部模式选择

现代酶标仪控制软件应具备：

• 一键切换“顶部/底部”检测模式；

• 显示底部通道当前波长、滤光片信息；

• 支持多通道顺序或同步检测编程。

4.2 自动孔位标定与数据校准功能

• 自动聚焦机制：通过激发光强回馈自动调整Z轴对焦位置；

• 孔位校准算法：自动识别偏移孔位置并优化孔中心对准；

• 边缘效应控制：通过校正算法或冗余读数抵消板边热场或光程误差。

4.3 实时数据采集与动力学支持

对需要长期动态监测荧光变化（如活细胞荧光动力学）实验，软件需提供：

• 时间序列采集：支持每隔X分钟读取一次，绘制实时曲线；

• 温控联动：与温控系统协同工作，实现长时间恒温记录；

• 数据可视化：以热图、曲线、等值图等形式呈现荧光强度分布。

五、底部荧光检测实验设计的外部条件

5.1 选用专用荧光板材

如Corning® Costar、Greiner Bio-One、Thermo Nunc等品牌的黑壁透明底细胞培养板是推荐选项，其特点包括：

• 高透光率；

• 无荧光背景干扰；

• 表面处理适合细胞贴壁；

• 有利于激发光穿透和发射光高效收集。

5.2 荧光染料与样本定位

为了提高底部激发效率，应优先选用贴壁细胞染料或将荧光分子定位在细胞底部区域，如：

• Calcein-AM：活细胞染料，细胞质信号；

• Fluo-4：钙离子探针；

• MitoTracker：线粒体染料，可用于底部定向追踪；

• GFP等荧光蛋白：表达定位于胞底区者更适合底部检测。

六、底部荧光检测的典型应用场景

6.1 活细胞高通量药物筛选

• 在96或384孔贴壁细胞板中进行细胞毒性检测；

• 荧光染料（如Resazurin、Calcein）用于评估细胞活性；

• 底部检测提高贴壁信号准确度，减少液面反光干扰。

6.2 多参数免疫荧光分析

• 多重染色的细胞样本，通过底部采集不同荧光波段信号；

• 利于实现自动化分析细胞周期、表型分类、信号通路状态。

6.3 三维肿瘤球检测

• 肿瘤球培养在透明底微孔板中，顶部检测受信号遮挡；

• 底部激发能穿透基质并从底部采集中心区域信号，增强深层样本的可测性。

七、潜在限制与注意事项

• 孔底厚度差异影响聚焦精度：不同批次微孔板可能导致Z轴误差；

• 易受凝胶、培养基干扰：需优化样品准备过程；

• 仪器对齐精度要求高：若自动定位不精确，底部光路很难捕获信号；

• 高通量时热积累问题：长时间光照易产生热影响，建议搭配温控系统使用。

八、未来发展趋势

1. 集成显微成像与荧光检测
   未来酶标仪将越来越多地集成显微镜模块，实现单细胞层面底部成像与荧光读取一体化。

2. 智能孔位自适应聚焦
   机器学习与实时反馈将优化自动聚焦精度，实现跨板批次差异自动修正。

3. 微流控与底部读数结合
   将底部荧光读数技术引入微流控芯片平台中，实现更小体积、更高分辨率的生物反应监控。

结论

要实现高质量的酶标仪底部荧光检测，必须从硬件、软件、耗材、实验设计等多方面协调匹配。酶标仪本身应具备专用底部激发与采集系统、高灵敏度检测器、高精度机械平台以及多波段激发能力。配合透明底微孔板、合适荧光染料、聚焦优化与自动化控制，方能发挥底部检测的全部潜能。

底部荧光检测不仅是传统荧光酶标实验的补充，更为活细胞研究、3D细胞模型、荧光动力学等提供了不可替代的技术基础。随着设备技术持续进步，底部检测将成为酶标仪平台中越来越核心的功能之一。科学管理、精准使用与系统整合，将是推动该技术广泛应用的关键。